细胞冻存方法及步骤

细胞冻存操作步骤：
1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗2遍；
2.加入适量胰酶，置于培养箱中消化，至细胞变圆变小；
3.待消化到位后加入等量完全培养基终止消化，800rpm离心5min；
4.配制冻存液，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，转移到冻存管中；
5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。

注意：
1. 密度的问题，ATCC建议的冻存量是10^6~10^7每mL，一瓶T75的细胞总数在1.5x10^7个这样，我一般冻存3~5支一瓶。

密度是复合ATCC的要求的。

2.冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1；
3.如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4度0.5h，-20度1.5h，-80过夜，大部分细胞也可以适应，但原代细胞不建议这么处理；
4. 需要长期保存的细胞尽快放到液氮中，最好过夜就放，最长不超过1星期，放的时候留一支，复苏看冻存效果。

-80超过三个月细胞基本就死绝了，除了极少数顽强的细胞。

在液氮液相中细胞无限期稳定。

5.细胞如果是第一次养，建议至少冻存两个批次以上，以尽量避免因为冻存问题导致细胞绝种；。

细胞冻存的方法及要点
细胞冻存的方法及要点如下：
1. 准备冷冻培养基，分装成1ml，冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。

也可以使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。

2. 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。

3. 每个冻存管中分装1ml冻存培养基，放置在冰上操作。

4. 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60℃或更低温度的冰箱，放置16~24小时。

5. 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。

如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。

6. 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。

细胞冻存可以保护细胞免受微生物污染、化学污染和物理损伤，是进行细胞储存、运输和交换的一种方法。

冻存前需确保细胞处于健康状态，密度适宜，并且在冷冻和复苏过程中采取适当的措施，以保证细胞的存活率。

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入42℃水浴锅中，轻微摇动。

液体都融化后
(大概1-2分钟) 。

2.把上述细胞悬液吸到恶评EP管或离心管中，1200转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞完全悬浮。

吸到装有培养基的10cm培养
皿或培养瓶中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后
换培养基。

5.2或3天换一次培养基。

二、传代
1.培养皿中的细胞生长率达到80%-90%时要传代。

2.把原来的培养基吸掉，加PBS冲洗1到2次，弃掉PBS。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-3分钟。

4.待细胞都变圆后加如入含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，把细胞完全都悬浮起来。

6.把细胞吸到EP管或离心管中，1200转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞完全都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿或培养瓶中。

三、冻存
细胞处理同二步骤中的前6步。

第七步用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到冻存管中，写明细胞种类，冻存日期。

4℃10min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

或直接放冻存盒中，再放到-80冰箱。

冻存液的配制：FBS：完全培养基：DMSO=5：4：1。

冷冻保存方法：（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。

-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。

适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。

（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（3）注意冷冻保护剂之品质。

DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。

Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。

在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。

1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。

细胞冻存的方法与步骤细胞冻存是一种常用的实验室技术，用于保留细胞的生物学特性和遗传信息，以备将来的实验或应用。

下面是细胞冻存方法和步骤的详细说明。

一、选择细胞种类和培养基1.选择要冻存的细胞种类，例如哺乳动物细胞、细菌或真菌等。

2.根据细胞种类和生长特性选择适合的培养基。

常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。

二、制备冻存试剂和材料1.冻存试剂：含有冷冻保护剂的冻存液。

常用的冻存液成分有细胞培养基、血清、DMSO（二甲基亚砜）等。

2.安全材料：包括手套、护目镜、口罩等，用于保护实验人员的安全。

此外，还需要准备液氮容器或冰箱进行冻存。

三、细胞处理步骤1.细胞预处理：将培养的细胞从培养瓶中取出，用生理盐水或PBS（磷酸缓冲盐水）洗涤去除残留物。

2.细胞计数：用显微镜和细胞计数仪来测量细胞的数目和浓度。

3.体积调整：根据所需的冻存密度和分装容器的大小，确定冷冻保护剂（如DMSO）的浓度和添加体积。

4.混合：将细胞悬液和冷冻保护剂轻轻地混合均匀。

5.分装：将混合物分装到冻存小管或冻存盒中。

6.封闭：使用不透气的盖子或密封膜封闭冻存管或盒。

四、冷冻过程1.控制冷冻速度：冷冻速度是细胞冻存过程中一个非常关键的因素。

常用的冷冻速度是每分钟1摄氏度以下，最佳速度约为每分钟1-2摄氏度以下。

2.冻存程序：使用冻存机或其他冻结设备进行控制冷冻，以确保温度降到适合储存细胞的温度。

一般常用的冻存温度为-80摄氏度或液氮温度（-196摄氏度）。

五、储存和解冻1.储存：冷冻管或盒应存放在专用的液氮罐中或冷冻设施中，避免频繁开启，以防止温度波动和冻存液的液态氮蒸发。

2.解冻：在需要使用时，将细胞冷冻管或冻存盒快速解封到37摄氏度恢复细胞的活性。

同时，快速将冰冻的细胞悬液转移到预暖的培养基中，以避免冷休克对细胞的伤害。

以上是细胞冻存的一般方法和步骤，实际操作时还要根据具体细胞类型和实验要求进行相应的调整和优化。

细胞冻存保留了细胞的生物学特性和遗传信息，为细胞的长期保存和应用提供了保障。

细胞冻存操作步骤
一、实验原理
细胞冻存是将细胞摄取入液体氮中，将温度降至-196℃使细胞凝固，抑制其体外反应而获得的一种实验技术。

通常细胞冷冻会用到药物，这样可以在降低温度时减少细胞损伤，并且能使细胞活力保持更长的时间。

这种方法的优势在于，当细胞再次受激时，他们会恢复其活性，因此这是可行的细胞保存方法。

二、必要的物品
1.细胞培养室：多孔培养板，细胞培养液，细胞接种液，营养物质，pH调节剂，拉曼光谱
2.低温冷冻室：冰箱，液氮储存器，液氮更换器，液氮锅
3.彻底冻存：冰浆，冻存管，硅胶垫，冰箱
4.实验室用品：滤纸，棉签，试管，去离子水，消毒消毒剂
1.操作前准备：
（1）确保冰箱和液氮储存器温度处于-196℃，并且安放在细胞培养室内；
（2）准备液氮储存器用的液氮，壶内放入10%药物混合液；
（3）准备液氮锅，放入冰浆以及用于完成冻存的各种容器；
（4）检查实验室所有必需的实验室用品，并且充分准备工作台的工作环境；
2.细胞冻存：
（1）将细胞用10%的药物混合液，并且用滤纸过滤后以試管装载；。

细胞冻存的原理与程序
细胞冻存是一种常用的细胞保存技术，用于长期保存活细胞，以便在需要时进行再培养和研究。

细胞冻存的原理是通过将细胞置于极低温度下，使细胞的代谢过程几乎停止，以保持细胞的生命力。

细胞冻存的程序一般包括以下几个步骤：
1. 预备工作：准备细胞培养基、冻存液、冻存容器等物品。

2. 细胞预处理：将要冻存的细胞进行预处理，例如收集细胞，检查细胞数量和活性等。

3. 细胞保护剂添加：将细胞保护剂添加到细胞中，以防止细胞在冻存过程中受到冷冻损伤。

4. 冷冻过程：将预处理后的细胞缓慢地冷却至极低温度，一般为-80°C或更低的液氮温度。

可以使用冷冻容器或专用的冷冻
装置来进行冷冻。

5. 细胞保存：将冷冻的细胞转移到冷冻容器中，通常使用试管、冻存管或冻存板等。

6. 冷冻液添加：将预先配制好的冻存液缓慢地加入冷冻容器中，以覆盖细胞完全。

7. 冷冻容器密封：将冷冻容器密封，以防止液氮和水蒸气进入。

8. 细胞保存条件：将冷冻容器放置在液氮罐中，存放在-196°C 的低温环境中。

细胞冻存的原理和程序都是为了保护细胞免受冷冻过程中的伤害，并确保细胞在解冻后仍能保持其生理功能和形态。

因此，在进行实验时，应尽可能控制好每个步骤的条件和操作，以确保细胞冻存的成功。

细胞冻存的操作步骤细胞冻存是一种将活体细胞保存在极低温度下以延长其存活时间和保持其生物特性的方法。

它在细胞培养以及细胞研究中起到了重要的作用。

下面将详细介绍细胞冻存的操作步骤。

1. 细胞培养准备在进行细胞冻存之前，首先需要准备好细胞培养的相关设备和材料。

包括培养皿、培养液、细胞培养基、离心机、试管、离心管和细胞培养箱等。

2. 细胞培养将待冻存的细胞进行培养，确保其处于良好的生长状态。

细胞培养过程中需要注意无菌操作，避免细胞受到污染。

3. 细胞预处理在进行细胞冻存之前，需要对细胞进行预处理。

通常会使用细胞凝胶、冷冻保护剂等物质对细胞进行保护，以减少细胞在冷冻过程中的损伤。

4. 细胞收获将培养皿中的细胞用无菌的移液器或离心机收集到离心管中。

在收集细胞的过程中，需要注意避免细胞的受损和污染。

5. 细胞计数使用细胞计数板或自动细胞计数仪对收获的细胞进行计数。

细胞计数的目的是确定细胞的浓度，以便后续的处理和保存。

6. 细胞冻存液的制备根据细胞类型和冻存液的要求，选择合适的冻存液进行制备。

常用的冻存液包括DMSO（二甲基亚砜）和甘油等。

7. 细胞冻存管的准备将细胞冻存液倒入预先标记好的细胞冻存管中。

在倒液的过程中，需要注意保持无菌操作，避免细胞的受到污染。

8. 细胞冻存管的封闭使用密封帽或其他密封装置将细胞冻存管严密封闭，以防止液体的挥发和细胞的受到污染。

9. 细胞冻存管的标记在细胞冻存管上标明细胞的信息，包括细胞类型、保存日期和冻存液的成分等。

标记的目的是为了方便后续的定位和使用。

10. 细胞冷冻将封闭好的细胞冻存管放入冷冻容器中，使用逐渐降温的方法进行冷冻。

通常会使用冷冻容器和液氮等冷却介质进行冷冻。

11. 细胞存储将冷冻好的细胞冻存管转移到液氮罐或冷冻保存设备中进行长期保存。

在存储过程中，需要保持细胞冻存管的密封性和温度的稳定性。

12. 细胞复苏在需要使用冻存细胞时，将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速解冻并将细胞转移到培养皿中进行复苏培养。

细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase 长期储存。

-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。

适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。

然后进行冻存。

4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。

GJ实验组专用（YDD制作）
细胞冻存方法：
（1）超净台紫外灯消毒30分钟。

（2）准备好培养液，PBS，移液枪，移液管等物品。

（3）培养液清澈，未见沉着物，镜下见少量漂浮细胞，细胞状态良好。

（4）吸取并丢弃瓶内的培养液。

（5）10ml PBS 清洗一遍。

（6）大瓶取1ml胰酶消化（小瓶取0.5ml消化）3-5分钟，镜下观察见细胞逐渐変圆，轻拍细胞培养瓶，见细胞从瓶底脱落。

（7）取少量的培养基终止消化。

（8）将细胞抽入一支干净的离心管，配平离心10分钟，1000转，弃上清。

（9）加上1.5ml冻存液（一大瓶细胞加1.5ml冻存液）吹散重悬。

（10）将重悬好的细胞加入冻存管密封保存。

（11）放入冻存盒过夜（-80摄氏度）。