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提dna步骤及原理DNA提取是一种分离纯化DNA的过程，它可以用于分子生物学的各种实验和研究。
以下是DNA提取的步骤及原理：步骤1：细胞破碎首先，需要将目标细胞破碎以释放DNA。
这可以通过机械方式（如刮取细胞）或者化学方式（如孵育细胞在酶溶液中）来完成。
破碎细胞的目的是破坏细胞膜和核膜，释放DNA。
步骤2：细胞溶解接下来，要将破碎细胞中的蛋白质和其他细胞组分溶解。
这可以通过加入表面活性剂（如SDS）来破坏蛋白质的结构，使其变为可溶解状态。
细胞溶解的目的是除去蛋白质和其他细胞成分，保留DNA。
步骤3：蛋白质沉淀通过加入盐类，可以使DNA溶液中的蛋白质形成沉淀。
盐类中的离子与蛋白质形成复合物，使其聚集在一起并沉淀到溶液底部。
这一步的目的是除去大部分蛋白质，净化DNA溶液。
步骤4：DNA沉淀将溶液中的DNA沉淀到管壁上，可以通过加入酒精或其他有机溶剂来实现。
这些溶剂改变了DNA溶液的物理性质，使DNA变得不溶于水而沉淀。
这一步的目的是分离纯化DNA。
步骤5：洗涤和纯化DNA最后，通过洗涤沉淀的DNA，可以除去残留的盐类和其他杂质。
洗涤可以使用乙醇或其他缓冲液。
洗涤后，可以用缓冲液溶解DNA并进一步纯化。
DNA提取的原理是基于DNA和其他细胞成分的物理和化学特性的差异。
其中，细胞破碎和溶解步骤破坏了细胞膜和核膜，并释放了DNA。
蛋白质沉淀和DNA沉淀步骤利用了盐类和有机溶剂对不同分子的溶解性差异，将蛋白质和DNA分离。
洗涤步骤则进一步清洁和纯化DNA。
整个过程旨在从复杂的细胞混合物中分离纯化出DNA，以便在后续实验中进行分析和应用。
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
细胞破碎技术
细胞破碎技术是一种将细胞壁破坏并使细胞内部成分释放出来的方法。
这种技术常用于提取和分离细胞内的蛋白质、DNA、RNA等分子。
常见的细胞破碎技术包括机械破碎、超声破碎、冻融破碎和化学破碎等方法。
1. 机械破碎：使用研钵、高速搅拌器、螺旋刀等机械设备对细胞进行破碎，通过物理力使细胞破裂，并释放出细胞内的分子。
2. 超声破碎：利用高频率的超声波对细胞进行振荡，产生剧烈的机械剪切力和微小气泡的崩溃，从而破碎细胞壁。
3. 冻融破碎：将细胞冷冻后迅速加热，重复冻结和加热的过程会使细胞壁破裂，并释放出细胞内的成分。
4. 化学破碎：利用化学试剂对细胞进行处理，如使用碱性溶液、表面活性剂或酶，以破坏细胞壁，使细胞破碎并释放出细胞内的分子。
细胞破碎技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域，可用于提取纯化目标分子、研究细胞内的代谢过程、检测疾病标志物等。
破碎技术除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
1.机械破碎(1)研磨研磨是将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。
工业生产中可用电磨研磨。
细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。
(2)匀浆匀浆这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min-20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒-20秒，停10秒-20秒，可反复多次。
(3)胶体磨胶体磨的基本原理是流体或半流体物料在离心力的作用下，强制通过高速相对运动的定齿与动齿之间，使物料受到强大的剪切力，磨擦力、高频振动和高速旋涡等复杂力等作用，有效地被粉碎、乳化、均质、混合，从而达到精细超微的效果。
定转子间的高速相对运动是使胶体磨工作获得物理微细度的主要条件，只有提高磨盘的精密度与线速度，才能达到良好的加工效果。
2. 物理破碎(1)压榨压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。
在1000×105Pa-2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
(2)冷热交替冷热交替是在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎，细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。
(3)反复冻融反复冻融是将待破碎的细胞冷至15℃-20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。
大肠杆菌细胞破碎的方法
大肠杆菌是常见的一种细菌，破碎大肠杆菌细胞可以用于提取蛋白质、核酸等目的。
以下是常用的几种大肠杆菌细胞破碎的方法。
1.物理破碎法：
(1)超声波破碎法：将大肠杆菌培养物置于超声波水浴中，通过高频
振动破碎细胞壁。
超声波破碎法操作简单，破碎效果好，但需注意温度控制，避免细胞内容物的热失活。
(2)高压破碎法：将大肠杆菌细胞悬浮液注入高压装置，通过高压力
将细胞破碎。
高压破碎法操作较复杂，需要高压装置，但破碎效果较好。
(3)化学破碎法：用氨基磺酸(SDS)等表面活性剂破坏脂膜结构，破碎
细胞。
2. 酶处理法：使用酶来消化大肠杆菌细胞壁，达到破碎细胞的目的。
常用的酶有裂解酶 (lysozyme) 和胰蛋白酶 (trypsin)等。
将大肠杆菌细
胞悬浮液与酶溶液混合，可在室温或低温下静置，待细胞壁完全消化后，
用冷离心机将细胞破碎。
3.冻融破碎法：将大肠杆菌培养物冷冻，然后加入浸泡在恒温水中的
冷微晶纤维素或硅胶颗粒，使细胞黏附在颗粒上。
再用离心机离心沉淀，
将上清液倒掉，然后加入冷离心缓冲液悬浮，再次离心沉淀，破碎细胞。
4.震荡方法：将大肠杆菌细胞悬浮液加入离心管或试管中，使用齿条
式震荡器或超声震荡器进行震荡，使细胞壁破碎。
细胞破碎的方法选择应根据实验的具体需求和条件来决定。
在选择方法时，应综合考虑细胞破碎效果、操作简便性、设备和试剂的可获得性，以及对目标物质的保护等因素。
学校代码：__11059__学号：1302021035
Hefei University
下游处理技术
XIAYOUC HULIJIS HUZONGS HU
论文题目：表面活性剂在细胞破碎的应用
学位类别：本科
学科专业：生物技术
作者姓名：刘壮
导师姓名：于宙
完成时间：2016.4.29
表面活性剂在细胞破碎的应用
摘要
表面活性剂的结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。
表面活性剂的结构特性赋予了其既能和水也能和脂类作用的特性。
表面活性剂是一类具有表面活性的物质，溶于溶液后，能显著降低液体表面张力，并能改变溶液的增溶能力。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，同时也含有蛋白质和脂质。
用表面活性剂处理后可增大细胞壁的通透性[1]，这就是表面活性剂在细胞壁的破碎的原理。
而细胞破碎是提取胞内产物的必由之路。
本文将重点讲述表面活性剂在细胞破碎的应用。
关键词：表面活性剂；cmc；原理
沿革
在工业生产中有些目标产物不再发酵液中，而在生物体中，尤其是基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分分泌到发酵液中，而是在细胞内乘积。
脂类物质和一些抗生素也是包含在细菌体中。
这时就需要进行细胞破碎。
细胞破碎的方法很多，但是他们适用的范围和破碎效率不同。
许多方法仅适合与实验室和小规模破碎。
目前工业上生产应用最广泛的是高压匀浆法和珠磨法，由于他们处理量大，速度非常快而备受青睐。
但是由于消耗机械能而产生大量的热量，使料液温度升高，容易造成生物活性的丧失容易造成活性物质的破坏[2]。
化学方法如增溶法，通过添加表面活性剂，溶解细胞壁的脂，造成细胞壁通透性的改变，从而达到细胞破碎的目的。
通过添加表面活性剂要比上述两种方法相对温和。
表面活性剂处理制成细胞悬液后可用离心分离除去细胞碎片，在用其他方法如吸附柱或萃取剂分离制得产品。
正文
一、表面活性剂的分类
表面活性剂的种类很多，分类方法也有多种。
比较常见的分类方法是根据表面活性剂在水溶液中的电离特性而将其分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂以及非离子表面活性剂四大类。
1.1 阴离子表面活性剂
阴离子表面活性剂是由一个诸如碳氢化合物类的憎水基与一个或两个亲水基相连接组成的表面活性剂。
在水溶液中发生解离形成一个带负电荷的离子(阴离子)和一个带正电荷的离子(阳离子)。
其中，阴离子是表面活性性质的载体。
它的分子中憎水基团所连接的亲水基团是阴离子。
阴离子表面活性剂是最先使用、应用范围最广、产量最多的一类表面活性剂，经常用在清洁配方中。
1.2 阳离子表面活性剂
阳离子表面活性剂含有一个憎水的碳氢基和一个或几个亲水基，在水溶液中也解离成阳离子和阴离子，其中阳离子为表面活性性质的载体。
它的分子中憎水基团所连接的亲水基团是阳离子。
大多数阳离子表面活性剂都是含有带有正电荷的氮原子，根据氮原子在分子中的位置不同分为胺盐、季按盐和杂环型三类。
常用的离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠（SDS），广泛用于细胞膜崩解，与膜蛋白的疏水部分结合并使其与膜分离，高浓度的SDS 还可以破坏蛋白质的离子键和非共价键，甚至改变蛋白质亲水部分的构象。
这一特性常用于蛋白质分析的SDS凝胶电泳[3]。
阳离子表面活性剂一般不能和阴离子表面活性剂混合使用，因为它所带的电荷正好与阴离子表面活性剂相反，若两者混合会产生沉淀，失去表面活性;但它能和非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂配合使用。
阳离子表面活性剂强烈地吸附在许多表面上，主要用途与原位表面改性相关。
1.3 两性离子表面活性剂
分子溶于水发生电离后，与亲油基相连的亲水基中同时含有阴、阳离子的表面活性剂叫两性离子表面活性剂。
它在碱性介质显阴离子性质，在酸性介质中显阳离子性质，在适当介质中显出阴、阳离子相等的等电点。
实际应用的品种主要是氨基酸型和甜菜碱型两性离子表面活性剂，产量是表面活性剂中最小的。
两性离子表面活性剂通常具有良好的洗涤、分散、乳化、杀菌、柔软纤维和抗静电等性能，可用作织物整理助剂、染色助剂、钙皂分散剂、干洗表面活性剂和金属缓蚀剂等。
但是这类表面活性剂的价格较贵，实际应用范围较其他类型的表面活性剂小。
1.4 非离子表面活性剂
非离子表面活性剂是其分子溶于水后，不发生电离的一类表面活性剂，其显示活性的部分不是离子。
非离子表面活性剂的疏水基是由含有活泼氢的疏水化合物，如高碳脂肪醇，烷基酚，脂肪酸，脂肪胺等。
其亲水基来源于含有醚基，羟基等基团 (这些基团能与水形成氢键)的低分子化合物，如环氧乙烷，多元醇，乙醇胺等。
按亲水基类别，非离子表面活性剂主要分为聚氧乙烯型和多元醇型两大类。
非离子表面活性剂在酸性、碱性及电解质溶液中均较稳定，并可与任何种类的表面活性剂配合使用，而不生成沉淀[4]。
二、表面活性剂原理
2.1 cmc
临界微团浓度（critical micelle concentration,cmc）表面活性剂在溶剂中低浓度存在时可以单独存在，在高于cmc时会形成小的球状聚集体称为微团[5]。
这在生产、实验室操作中十分重要。
2.2原理
当表面活性剂溶液浓度增加（大于cmc）时，在水中倾向于形成微团，亲水的部分朝外，疏水的部分聚集在中心。
搅拌混合物时，可以使细胞与表面活性剂充分接触，细胞壁上的脂类被裹上表面活性剂分子，使之处于微团中，从而增大细胞壁的通透性，达到细胞
破碎的目的[5]。
总结
表面活性剂可以溶解细胞壁的脂，造成细胞壁通透性的改变，从而达到细胞破碎的目的。
其原因是因为其独特的结构（含一个亲水基团和一个疏水基团）。
表面活性剂处理制成细胞悬液后可用离心分离除去细胞碎片，在用其他方法如吸附柱或萃取剂分离制得产品。
表面活性剂的分类方法很多，比较常见的分类方法是根据表面活性剂在水溶液中的电离特性而将其分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂以及非离子表面活性剂四大类。
参考文献
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[4]郑凤仙. 表面活性剂在固液界面及限制空间中的吸附和聚集行为的分子模拟研究[D]. 北京：北京化工大学，2009.2-5.
[5]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学上册[M]. 第二版. 北京：高等教育出版社，2002.80.。
