第6章 肿瘤细胞的培养

肿瘤细胞的培养一、体外培养肿瘤细胞的生物学特性体外培养的肿瘤细胞与体内正常细胞相比，在形态、遗传性状等方面都有显著的不同，而生长在体内的肿瘤细胞与在体外培养的肿瘤细胞也并非完全相同。

1、永生性永生性又称不死性，即在体外培养的肿瘤细胞一旦被建成细胞系，瘤细胞便可无限增值而不凋亡。

体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种形状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。

从今年建立细胞系或细胞株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养；而事实上，多数肿瘤细胞初代培养是并不那么容易，大多数也出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。

在经过纯化成单一化瘤细胞后，在增值若干代后，才能顺利传代生长下去，获得永生性。

从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。

2、形态和形状培养中癌细胞无特异形态，镜下观察时大多数肿瘤细胞比二倍体细胞清洗，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。

电镜观察癌细胞表面的微绒毛多且细密，微丝走形不如正常细胞规则。

3、侵袭性侵袭性是肿瘤细胞的扩张型增值行为，体外培养的癌细胞仍持有这种性状。

当与正常组织混合培养时，它能侵入其他组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。

4、生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。

癌细胞在低血清中（2%~5%）仍能生长，而正常二倍体细胞在体外培养中如不加含有促进细胞增殖生长因子的血清就不能增殖，因为肿瘤细胞有产生促增殖因子的能力。

正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，这已成为检测细胞恶变的一个指标。

正常细胞在体外汇合时，细胞间会发生接触抑制。

而癌细胞或培养中发生恶性转化后的细胞能消除接触抑制，能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物，因而肿瘤细胞在软琼脂（半固体琼脂）中形成集落的能力比正常细胞强。

5、细胞遗传大多数肿瘤细胞的遗传学性质发生改变，如失去二倍体核型、呈一倍体或多倍体等。

6、异质性所有肿瘤都是由具有不同的增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状的细胞组成，即肿瘤的异质性。

肿瘤的细胞培养实验研究引言：细胞培养实验是现代生物医学研究中不可或缺的实验手段之一，它为了研究和分析生物体的细胞行为和生理过程提供了一种可控、可重复的实验环境。

在肿瘤方面，细胞培养实验可以帮助科研人员更深入地了解肿瘤细胞的生长、分化、生理功能以及药物对肿瘤细胞的影响。

本文将介绍肿瘤的细胞培养实验研究的基本过程、方法和应用。

一、肿瘤细胞培养实验的基本过程肿瘤细胞培养实验的基本过程主要包括细胞的收集、传代培养、细胞的鉴定和使用。

1.细胞的收集：肿瘤细胞可以通过肿瘤组织切片、原发培养物或小鼠移植瘤等方式收集。

为了避免细胞外污染，收集的过程需要在无菌条件下进行。

2.传代培养：收集到的肿瘤细胞需要在适当的培养基中进行传代培养，以保证细胞的生长和繁殖。

培养基中通常含有人工合成的营养物、生长因子和其他必需的成分。

3.细胞的鉴定：细胞的鉴定通常包括细胞学形态学观察、免疫细胞化学染色和细胞分子学鉴定等。

这些方法可以帮助科研人员确认培养的细胞是否为肿瘤细胞。

4.使用肿瘤细胞：经过鉴定的肿瘤细胞可以用于研究肿瘤发生机制、药物筛选、肿瘤模型制备以及其他科学研究。

二、肿瘤细胞培养实验的方法在肿瘤细胞培养实验中，常用的方法包括传统的贴壁培养法和悬浮培养法。

1.贴壁培养法：贴壁培养是最常见和最简单的肿瘤细胞培养方法。

在此方法中，肿瘤细胞会附着到培养皿的底部，并在培养基中生长繁殖。

这种方法适用于肿瘤细胞具有附着性的类型，如肺癌细胞、结肠癌细胞等。

2.悬浮培养法：悬浮培养法适用于肿瘤细胞具有悬浮生长的类型，如白血病细胞、淋巴瘤细胞等。

在此方法中，肿瘤细胞会悬浮在培养基中，并通过摇床等设备进行培养。

三、肿瘤细胞培养实验的应用肿瘤细胞培养实验在肿瘤研究中有着广泛的应用。

以下是其中的几个方面：1.研究肿瘤发生机制：通过细胞培养实验，科研人员可以对肿瘤细胞进行生长、增殖、分化、凋亡等方面的研究，从而深入了解肿瘤发生的机制。

2.筛选抗肿瘤药物：通过细胞培养实验，科研人员可以在体外模拟人体内的环境，研究不同药物对肿瘤细胞的毒性和治疗效果，从而筛选出潜在的抗肿瘤药物。

一、反复帖壁法
1．待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。

2．取编号为A、B、C三个培养瓶。

首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后，向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。

3．培养B瓶中细胞5～20分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶补加完全培养基。

二、机械刮除法
1．标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。

2．刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。

3．用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞。

4．注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。

三、消化排除法
1．先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养基细胞一次，然后再换成新的混合继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。

2．把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养，向原瓶内也补加新的培养液继续培养。

用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。

四、胶原酶消化法
1．可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化。

2．用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。

如成纤维细胞未被除净，可再次重复。

第6章肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。

癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。

应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。

(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。

(4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。

(5)研究周期短，比较经济。

但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。

一、肿瘤细胞培养的生物学特性1、形态和性状形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。

折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。

2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。

3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。

但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。

另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。

但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。

肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。

培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。

1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。

2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。

以（5~10）x108个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。

3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。

4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。

实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤一、实验目的了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养基的配制和灭菌方法，掌握动物细胞培养的一般方法二、实验原理（一）、实验用具的清洗1、玻璃器皿的清洗组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。

一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。

清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。

再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。

刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。

浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。

使之尽量不留污染或洁液的残迹。

冲洗最好用洗涤装置。

即省力、效果又好。

如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。

2、胶塞的清洗先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。

自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

3、塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

（二）、灭菌和消毒培养液、橡胶制品、10磅10分钟；布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。

（三）、培养基的配制1、平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成。

肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。

它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。

本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。

一、肿瘤细胞培养的基本原理肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。

培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。

二、肿瘤细胞培养的方法1. 细胞来源选择肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。

可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。

选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。

2. 细胞分离和传代细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。

分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。

3. 细胞培养条件细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。

首先是选择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。

此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。

4. 细胞检测和鉴定培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。

常用的方法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。

鉴定后的细胞可以用于进一步的实验研究。

三、肿瘤细胞培养的应用1. 药物筛选和耐药性研究肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。

此外，肿瘤细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。

2. 基因功能研究通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。

肿瘤细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。

1肿瘤细胞的培养1.1 贴壁细胞的传代培养当细胞长满瓶底80%~90%时，需要更换细胞培养液，进行传代。

在操作之前，应仔细检查所培养的细胞有无污染或发生细胞变性，若有则丢弃。

具体操作如下：（1）倾去培养瓶中的旧培养液，用PBS 缓冲液或Hanks 液洗涤1~2 次；（2）加入胰蛋白酶消化液，用量以刚好没过细胞层为宜。

室温下消化贴壁细胞，至轻轻倾斜培养瓶细胞能剥离，或在显微镜下观察到细胞形状变圆细胞间隙增大时立即终止消化；（3）倒去消化液，加入2~3mL PBS缓冲液或Hanks 液，轻轻洗涤细胞1~2次，去除残留的消化液；（4）倾去洗涤液，加入少许新鲜培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液；（5）将细胞悬液接种至预装有新鲜培养基的培养瓶中，置37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。

1.2 悬浮细胞的传代培养当观测到细胞密度较大时，及时进行换液、传代；（1）将细胞培养液转入离心管中，1000~1500r/min 离心3~5min，去上清；（2）加入少许新鲜培养液，将细胞沉淀制成悬液；（3）取适量细胞悬液接种至预装有新鲜培养基的培养瓶中，置37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。

1.3 肿瘤细胞的冻存（1）取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，调节细胞数1×104～1×107；（2）25℃，2000r/min 离心5min，去上清；（3）加入含10% DMSO 的细胞培养液，混匀；（4）分装到2mL 冻存管中，贴上标签，标注细胞名称及冻存日期；（5）采用梯度降温：先于4℃冰箱中预冷30min，然后将冻存管置于-20℃冰箱中30min，最后保存于-70℃超低温冰箱（李纯等，2000）。

1.4 肿瘤细胞的复苏（1）取烧杯，装入干净温水，水温37℃为宜；（2）将保存有肿瘤细胞的冻存管从-70℃超低温冰箱中取出，迅速放入温水中解冻，轻轻摇动使快速融化，时间约1min；（3）用75℃酒精擦拭冻存管盖边缘后，于超净台中吸取细胞悬液转入离心管中，补加8mL 培养基，混匀；（3）25℃、2000r/min 低速离心5min，弃上清，加培养基再重复离心清洗一次；（4）加适量培养基稀释后，转入培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。

当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。

另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。

肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。

肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。

生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。

培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。

电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。

正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。

已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。

正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。

癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。

另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

（三）永生性永生性也称不死性。

在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。

体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。

因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。

体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。

从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。

肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。

一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。

用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。

也可以考虑动物媒介培养。

根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。

具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。

二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。

三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。

注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。

新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。

自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。

细胞计数可在有菌环境中进行。

3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。

4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。

5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。

凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。

经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。

总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。

近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。

但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。

众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。

另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。