实验一、骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二材料：
1.试剂：
（1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。
不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。
（2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。
（3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
2.器材：
超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等
三方法：
细胞冻存及复苏
先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
四、细胞培养应注意事项
1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒，对于新购置或已经使用的玻璃器皿，一般先用先用0.1%新洁而灭浸泡24小时，再用自来水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡24小时，带胶手套，捞起，用自来水将酸液冲洗干净（一般冲洗8-10次），用去离子水浸泡12小时，再用超纯水浸泡12小时，捞起烘干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管桶内，165.5℃干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。
2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是DMEM或RPMI-1640，按厂家规定的方法配制一般不会出问题。但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素因各地水质差异很大，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。国内实验室大多采用新生犊牛血清配制培养基，不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异很大，应筛选出好的血清供作配制融合后选择性培养的HAT培养基。
准备重组药物的实验：
1、配制AMP+ LB固体培养基600ml，倒AMP+ LB平皿 20个
2、AMP+ LB液体培养基400ml
3、空的试管20支
4、1.5ml EP管1盒
将以上灭菌。
附：LB培养基配方：
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
另外根据经验值用5mol/LNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板
①配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉
②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
③倒板：一般20ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
④保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
抗生素终浓度Amp 100ug/ml
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。 一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。 布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤： （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞 （2）原代培养24h,48h各换液一次 （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来 （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。 （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。 （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。 菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。 天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
杂交瘤细胞的制备 1. 骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。 2. 脾淋巴细胞的准备 a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。 b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。 c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。 d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。 3. 饲养细胞的制备 取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。 4. 细胞融合 a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。 b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。 c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。 d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL （遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm离心10min，弃上清。 e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。 f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。 g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。 h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
多发性骨髓瘤（MM） 定义：多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中积聚浆细胞为特征的恶性肿瘤，可导致骨质破坏和骨髓衰竭。临床表现 多发性骨髓瘤起病徐缓，早期无明显症状，容易被误诊。主要有贫血、骨痛、肾功能不全、感染、出血、神经症状、高钙血症、淀粉样变等。 1.骨痛、骨骼变形和病理骨折 骨髓瘤细胞分泌破骨细胞活性因子而激活破骨细胞，使骨质溶解、破坏，骨骼疼痛是最常见的症状，多为腰骶、胸骨、肋骨疼痛。由于瘤细胞对骨质破坏，引起病理性骨折，可多处骨折同时存在。 2.贫血和出血 贫血较常见，为首发症状，早期贫血轻，后期贫血严重。晚期可出现血小板减少，引起出血症状。皮肤黏膜出血较多见，严重者可见内脏及颅内出血。 3.肝、脾、淋巴结和肾脏病变 肝、脾肿大，颈部淋巴结肿大，骨髓瘤肾。器官肿大或者异常肿物需要考虑髓外浆细胞瘤或者淀粉样变。 4.神经系统症状 神经系统髓外浆细胞瘤可出现肢体瘫痪、嗜睡、昏迷、复视、失明、视力减退。 5.多发性骨髓瘤多见细菌感染 亦可见真菌、病毒感染，最常见为细菌性肺炎、泌尿系感染、败血症，病毒性带状庖疹也容易发生，尤其是治疗后免疫低下的患者。 6.肾功能损害 50%～70%病人尿检有蛋白、红细胞、白细胞、管型，出现慢性肾功能衰竭、高磷酸血症、高钙血症、高尿酸血症，可形成尿酸结石。 7.高黏滞综合征 可发生头晕、眼花、视力障碍，并可突发晕厥、意识障碍。 8.淀粉样变 常发生于舌、皮肤、心脏、胃肠道等部位。 初始诊断检查 所有患者的初始诊断检查应包括病史、体检以及以下基线血液和生化检查，以便区分症状性和无症状性MM：完整的血细胞计数（CBC）（带分类计数和血小板计数）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐、血清电解质、血钙、白蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、β2微球蛋白。BUN和肌酐升高提示肾功能减退，而LDH水平有助于评估肿瘤细胞负荷。β2微球蛋白水平可反映肿块情况，现在被认为是评估肿瘤负荷的标准指标。 大部分患者存在血清蛋白，伴或不伴相关尿蛋白。 为评估骨髓浆细胞浸润情况，建议行骨髓穿刺检查或活检以定量和/或定性了解骨髓浆细胞异常情况。为评估溶骨性病变情况，建议行全面的骨骼影像学检查。 诊断分类 初步将患者分为冒烟型（无症状）骨髓瘤或活动性(有症状)骨髓瘤。 国际骨髓瘤工作组（IMWG）商定的冒烟型（无症状性）患者标准包括低浓度M蛋白（≥30g/L）和/或骨髓浆细胞浸润≥10%；但并无无贫血、肾功能衰竭、高钙血症或骨病变。 冒烟型（无症状性）骨髓瘤 冒烟型（无症状性）骨髓瘤为无症状及无器官或组织受损的病程阶段。Durie-SalmonI期骨髓瘤患者伴低M蛋白、无明显贫血、高钙血症及骨疾病，应属此类。无症状性冒烟型MM患者在未治疗情况下常呈慢性病程持续很多年。 有症状骨髓瘤 血/尿M蛋白：无血、尿M蛋白量的限制，大多数病例IgG>30g/L或IgA>25g/L或24h尿轻链>1g，但有些有症状MM患者低于此水平
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，
小鼠骨髓基质细胞 小鼠骨髓基质细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓基质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓基质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠骨髓基质细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓基质细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
作者单位:第四军医大学口腔医学院颌面外科,西安(710032 作者简介:刘彦普(1956-,河北人,副主任医师. 骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展 RESEARCH PR OGRESS ON BONE MARR OW MATRIC CE LL IN BONE TISSUE PR OJECT 刘彦普,钱奇春,杨维东 中图分类号:R322.7文献标识码:A 文章编 号:100524979(20020320229204 种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应具备以下特点:①取材容易,损伤小;②易定向分化为成骨细胞,传代繁殖力强;③适应性强,植入机体后能保持成骨活性。目前,作为骨组织工程的种子细胞有4种来源:骨、骨外膜、骨髓、骨外组织。这些来源各有优缺点,其中骨髓来源的骨髓基质细胞(b one m arrow strom al cell ,BMSC 具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化力强、易于接种成活等优点,在骨组织工程中显示出良好的应用前景。1BMSC 的成骨潜能 骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织,由基质细胞和细胞间基质构成。骨髓成骨能力主要来源于BMSC 中的成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblast ,CFU 2F ,它具有多向分化潜能,在特定培养条件下可转化成多种间充质细胞,如成纤维系细胞、成骨系细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等[1]。Mani 2atopoulos [2]等首次观察到鼠BMSC 在体外培养条件下 具有形成钙化的骨样组织的能力,X 线衍射分析表明 钙化物具有与骨组织类似的羟基磷灰石结构,免疫组织化学显示BMSC 产生I 型胶原,骨钙素(osteocalcin ,OC 与骨涎蛋白表达阴性。Benayahu [3]等将BMSC 体外
杂交瘤细胞培养及其注意事项 单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。 标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体 随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。 1杂交瘤的起源和生产 1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。 1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。 1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。脾脏是大量T或B细胞的来源，与小鼠骨髓瘤细胞融合时，最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，其”后代”也只能产生此种抗体，因为抗体是由DNA上的基因所决定，基因是可以遗传的。在正常情况下，小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞，一只纯种小鼠体内可有（1～5）×107种不同的抗体，即有（1～5）×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会，就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，然后经过多次筛选，从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时，又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性，从而可以无限制地提供
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植
杂交瘤细胞培养冻存与复苏 杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作： 【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制 ①RPMI-1640基础培养液，1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。效期不超过三个月。 ②RPMI-1640完全培养液，100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3％L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。 ③200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。 ④双抗溶液 青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。 杂交瘤细胞的保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910167483.7 (22)申请日 2019.03.06 (83)生物保藏信息 CCTCC NO：C201929 2019.03.05 (71)申请人 思格（苏州）生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区金鸡 湖大道99号苏州纳米城西北区20幢 403-17 (72)发明人 任宝永 沈飞 (74)专利代理机构 苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 代理人 王鑫 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 5/20(2006.01) G01N 33/68(2006.01)G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称 一株杂交瘤细胞制备及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种分泌抗人PD -1分子单克隆 抗体杂交瘤细胞的制备方法，以及根据该方法获 得的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。本发明所述 单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CCTCC NO： C201929。所述方法包括小鼠免疫、细胞融合与、 抗人PD -1抗体检测、杂交瘤细胞克隆。本发明的 分泌高效价抗人PD -1分子单克隆抗体的杂交瘤 细胞株能够持续性地产生抗人PD -1分子单克隆 抗体，为检测癌症病人PD -1分子表达提供了抗体 源。权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图4页CN 110423276 A 2019.11.08 C N 110423276 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110423276 A 1.鼠抗人PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C201929。 2.鼠抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于该抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生。 3.保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1 单克隆抗体在流式免疫荧光检测细胞表面PD-1抗原表达中的应用。 2
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立 一、实验目的： 1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识 二、实验原理： 细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。 培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的 三、材料：实验小白鼠 四、药剂及配制：
五、仪器器材： （1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台 检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品 用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染 浸泡 ?用5%的盐酸溶液浸泡过夜 刷洗 ?用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净 浸酸 ?将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1L)浸泡过夜 冲洗 ?将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用 第二部分原代培养 器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养瓶×2，冰块 试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水仪器：超净工作台、离心机、显微镜步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸 泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入 培养瓶。
实验一、骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同 一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640, DMEM培养基。小牛血清的浓度 一般在10?20%,细胞的最大密度不得超106/ ml, 一般扩大培养以1 : 2稀释传代，每2? 3天传代一次。细胞的倍增时间为16?20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴 壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 二材料： 1. 试剂： （ 1 ）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640 或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4 C保存。 不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100 X L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml, 7.5% NaHCO溶液1-2ml , HEPES溶夜1ml。 不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml, NaHCO3.7g , 100X L.G. 溶液10ml，双抗溶液10ml , 7.5% NaHCO溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4C保存。 完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml ,用于骨髓瘤细胞SP2/0 和建株后杂交瘤细胞培养。 （2）小牛血清灭活：从-20 C冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56C 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶）,-20 C冻存备用，尽量避免反复冻融。 （3）青、链霉素（双抗）溶液（100X ）取青霉素G （钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20 C 冻存。 2. 器材： 超净工作台、CQ恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml 细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等 三方法： 细胞冻存及复苏 先用24 孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株, 当长满时, 再扩大到100ml 细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10% DMS0 40% FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3 X 106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70 C冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40C水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min,弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞,移入24 孔板中培养。 四、细胞培养应注意事项 1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒,对于新购置或已经使用的玻璃器皿,一般先用先用0.1%
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9
MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理
生理学报 Acta Physiologica Sinica , August 25, 2006, 58 (4): 370-376 https://www.doczj.com/doc/2116300004.html, 370 研究论文 Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251). * Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@https://www.doczj.com/doc/2116300004.html, 人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选 刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李 东，贾孟春* 国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081 摘 要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs ，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d 的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA 消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank 人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d 的BMSCs 中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。RT-PCR 检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞。关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R 329 Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at defined stage of differentiation LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun * National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China. Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs cultured for 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive clones were selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed in BMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that the osteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-day than that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene 正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs 是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨祖细胞系。BMSCs 具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增 殖并分化为前成骨细胞，同时表达I 型胶原和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I 型胶原的合成在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化
多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义多发性骨髓瘤是一种常见的浆细胞恶性肿瘤，重要的染色体与基因异常导 致疾病的进展，在多发性骨髓瘤中具有独立的预后判断价值。随着检测方法的更新及技术的进步，异常染色体与基因的检出率越来越高，主要包括13号染色体全部或部分缺失伴或不伴14q32/IGH的重排等染色体异常。异常染色体与基因的检测具有重要价值，可完善MM预后评估体系，指导临床个体化治疗并为新药开发提供新的靶点。 标签：多发性骨髓瘤；分子细胞遗传学；预后 1染色体数目异常 1.1超二倍体 MM患者超二倍体主要表现为1、3、7、9、11、13、15、17、18、19、21、22三体型[1]；另外，近年来国内也有人发现MM患者8号染色体三体，王晓炜等[2]应用荧光免疫表型和间期细胞遗传学（FICTION）技术对MM骨髓涂片进行8号染色体检测，9例MM患者中，发现8号染色体三体1例，这可能与应用FICTION技术提高了检测效率有一定关系。 1.2亚二倍体 MM患者亚二倍体主要表现为6、8、13、14、X、Y单体型为特征；其中13号染色体单体缺失及其部分缺失是目前研究较为广泛的染色体异常之一。 2染色体结构异常 2.113号染色体异常 13 号染色体部分或完全缺失是MM 最早发现的染色体异常，MM 中较常见，而且是MM预后及生存期预测的指标之一。13号染色体异常，特别是13单体（-13）和13号染色体长臂部分缺失（13q-）与MM预后的关系越来越受到重视。目前认为13号染色体上存在MM 抑癌基因，其缺失与疾病危重、疗效和预后密切相关。Pérez-Simón等[3]采用荧光原位杂交（FISH）方法分析了15 种不同染色体异常在常规剂量化疗患者中的预后价值，发现13号染色体缺失是最重要的预示生存期短的预后指标，但对治疗反应无影响。由于13q-的断裂点范围在13q11~13q14，RB1基因正好也于这个区域，因此有人推测13号染色体完全或部分缺失所致MM预后不良可能与RB1基因改变有关。 Chiecchio等[4]通过FISH技术对400例新发MM患者染色体检测发现，至少有一种染色体数目或结构异常者达99%，其中13号染色体缺失：单体缺失及部分缺失约占47%。Fonseca等[5]采用cig-FISH 技术在54%的MM患者中检测
杂交瘤技术制备单克隆抗体 来源：https://www.doczj.com/doc/2116300004.html, 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体制备的一般流程如下:
单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后