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重组人IL-4大肠杆菌表达与纯化

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中图分类号
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燕等： 重组人 *+,! 大肠杆菌表达与纯化
$ 福建师范大学生命科学学院，福州
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! 上海新生源生物医药有限公司，上海
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白细胞介素 ! （ "#$%&’%()"# !， 是 -./0 年 *+,! ） 1234&5 在 6 细胞培养上清中发现的一种促进 7 细 胞增殖的生长因子 ， -./8 年基因克隆成功 。 *+, 主要生物 ! 是由 690 细胞产生的特征性细胞因子， 学功能包括协同激活抗 *:; 抗体依赖的 7 细胞、 介 导 *4 抗原对休眠 7 细胞的诱导作用、 促进 *:< 和 刺激 6 细胞系生长或维持它的激活状 *:= 的产生、 ［0 > !］ 态等 。由于 *+,! 具有广泛的生物学活性， 国外 应用 &9*+,! 治疗多种疾病进行了深入的研究， 包括 ［? > @］ ［/， .］ 肿瘤 、 缺氧引起的组织损伤 、 自身免疫性疾 病
［-0 > -?］
。采用何种方式
来表达 *+,!， 控制表达工艺， 提高纯化后目的产物的 得率， 是 &9*+,! 产业化研究的重点。 通过对人 *+, 本研究采用了 B<6 系统表达 *+,!， 获得了高水平 ! 基因的优化并选用高效表达载体， 的表达 菌 株； 通 过 控 制 发 酵 条 件， 达到了较高的 在此基础上对包涵体形式表达的 &9*+,! 表 达 率； 建立 &9*+,! 的纯化方法进行了大量的摸索和研究， 了较佳的纯化路线， 得到了高纯度、 高得率、 高活性 的 &9*+,! 蛋白。
等， 成为人们研究的热点之一。研究表明， 糖
［--］
基对 *+,! 的生物活性似乎没有影响 ， 大肠杆菌表 达的 *+,! 生物活性与哺乳动物细胞的表达产物相 当
［-0］
。大肠杆菌生产重组蛋白具有容易操作、 生长
迅速和培养基要求简单等优势， 因此重组 *+,! 的表 达大多采用大肠杆菌表达系统。国外对 *+,! 在大 肠杆菌中的表达和纯化工作报道相对较少， 文献报 道的表达量不高， 而且以包涵体形式表达， 必须通过 包涵体洗涤、 蛋白变性、 复性等一系列的步骤来达到 纯化目的， 因此最终得率很低
!
!"!
材料与方法
［-A］ ［-］ ［0］
序列。 *+,! 基因的人工合成由上海生工生物工程技 术有限公司完成， 合成基因克隆于 BUV?@ 载体的多 克隆位点， 重组质粒命名为 BUV?@J*+,!。 优化的基因序列如下： T4T 44: $:T :4$ 4$T 4TT T$: T4: :4: 4$T 4$T 444 4T$ $$: 44T 4:T T$$ 4T4 :4: T4: 44: 4T$ T$: $:T 4TT :4: $$: 4TT :$4 4T4 :4T 4$T $$$ :T$ :TT $TT 44: 44T 4T4 4T$ :4: 44: :44 4TT $$T $:T 4:4 :T$ :T$ 4T$ :$: T$$ T:: T44 $$T $4T 4:T T4T T4$ :4: 44: :4T 4T$ T:T $:T T$: ::$ :T$ 4T$ :T4 T4: T4: $$T T4T 4:4 T4T 44: T4: T$: 4$T 4:4 $$T T$: 444 T:: T$$ :4T 4:4 44T T$$ $:: ::4 T$: :T$ ::T T$$ 44$ $TT $:$ TT$ :$: 44: :44 :TT 44T T4: 4:$ 4T$ $$: :44 44T $$T $$: :44 4:4 T$4 44: 4T$ 4$T 4$: 4:4 :4: 444 $4$ $T4 444 $:$ 4:$ 4:T $:4 $44 设计一对 LVK 引物， 在目的 !"#"# 工程菌的构建： 基因的 ?W端引入 ()* "位点， CW端引入 !"# K"位点， （D） 载体的 ()* " 和 !"# K" 位 便于克隆到 B<6CA4 点之间。引物序列如下： Q2&34&5 B&"S%&： ?W,==II66VVI6I6=VIV II=6=V=I6I6VIVVV6=V, CW K%H%&X% B&"S%&：?W,=VV=II66V66I6VI=V6IV6 IVI6666=II6I666V,CW 用 BY( 酶对 *+,! 的合成基因进行扩增， LVK 产 物经 ()* "和 !"# K"酶切后， 克隆到 B<6CA4 （D） 载 体的 ()* " 和 !"# K " 位 点 之 间， 构建重组质粒 （D） 重组质粒进行 FGI 序列测定确 B<6CA4 J&9*+,!， 认。将构建正确的表达质粒转化 ! E "#$% 7+0（F<C） 感受态 细 胞， 从 而 获 得 &9*+,! 的 表 达 工 程 菌 7+0（F<C） （D） JB<6CA4 J&9*+,!。 挑选单克 !"#"$ &9*+,! 的表达及表达形式的确定： 隆 7+0（ F<C） （D） （含 JB<6CA4 J&9*+,! 于 +7 培养基 卡那霉素 CA ， :JS+） C@Z 培养至 +,8AA 约为 A[8 时， $ 添加 *L6= 至终浓度 - SS2’J+ 诱导表达， OFO,LI=< 检测并分析重组蛋白表达量。收集诱导后的菌液离 心， 沉淀重悬于破菌缓冲液 （ 0ASS2’J+ 6&"X・V’， ， 在冰浴下超声破菌， 离心， A[-?S2’J+ G4V’， B1/[A） 收集超声上清和超声沉淀， OFO,LI=< 检测重组蛋白 的表达形式。 !"#"% 挑取 7+0（ F<C） &9*+,! 的规模发酵及纯化： J （ ） 单克隆于 培养基 （含卡那霉素 +7 B<6CA4 D J&9*+,!

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再生基因4(RegⅣ)的原核表达、蛋白结构复性及纯化

再生基因4(RegⅣ)的原核表达、蛋白结构复性及纯化

·论著·再生基因4（regenerating geneⅣ，RegⅣ）为钙依赖性凝集素（c型凝集素）超家族的一员，是一种小分子分泌性蛋白质，分子量约为18.2KD，由158个氨基酸构成，包括22个氨基酸的信号肽和一个C型植物凝集素识别结构域［1，2］。

RegⅣ蛋白在消化道肿瘤、生殖系统及其他系统肿瘤以及溃疡和炎性组织中呈高表达［3-5］，在正常胃肠道及胰腺中的表达水平非常低；其异常表达能够显著促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和迁移，抵抗凋亡，并可提高肿瘤细胞对化疗药物和放射线的耐受水平［6，7］。

本研究团队前期对胃癌中RegⅣ和SOX9的调控关系进行了研究，发现Reg IV可能通过调控SOX9的表达水平参与胃癌细胞的侵袭和迁移［8］。

可见，RegⅣ在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。

本研究在大肠埃希菌系统中构建携带目的基因的原核表达质粒，诱导表达人RegⅣ全长重组蛋白，并对表达的包涵体蛋白进行结构复性、纯化，为制备RegⅣ单抗及开发新型的RegⅣ抗癌靶向治疗药物奠定基础。

1材料与方法1.1材料 E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）购自Merck 公司；pET-30a表达载体为中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；DNA Marker，蛋白质Marker，限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ，T4DNA连接酶购自Takara公司；异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），纯化试剂盒，质粒提取试剂盒购自大连宝生物公司；本研究所用其他相关试剂均为国产分析纯；pEGFP-C1-RegIV质粒由本实验室前期试验构建保存（酶切位点为KpnⅠ/BamHⅠ）。

1.2构建pET-30a-RegIV重组质粒将本实验室前期构建保存的序列正确的pEGFP-C1-RegIV质粒［8］再生基因4（RegⅣ）的原核表达、蛋白结构复性及纯化徐杨1张学良2杜惠芬1柴丹丹1连晓雯1张瑞君1李克生11.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州730050；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃兰州750050【摘要】目的：构建再生基因4（RegⅣ）的原核表达载体，获得重组人RegⅣ蛋白。

大肠杆菌系统表达和纯化流程

大肠杆菌系统表达和纯化流程

转化及表达鉴定：3~4天（表达不明显做WB或者
换感受态）
常用的感受态：Bl21（DE3）、BL21(DE3)pLysS 、
Rosetta(DE3) 、OrigamiB(DE3)等
扩大培养：3~4天，根据表达鉴定的结果选择最
优的表达条件扩大
纯化：2~14天，多步纯化后蛋白仍不符合要
求或量不足，则重新扩大
：1~2天，带标签需要WB，tagfree需要
做质谱。

所以蛋白发货前要冻融测
试2次。

总量：1mg，3mg或者其他；1L或小试纯化（得到数据后可根据得率在扩大）
纯度：85%；90%；95%（灰度分析方法或HPLC方法）
浓度：≥0.1mg/ml
基因优化：蛋白序列大小>80kd，（能否提供基因序列，是否需要优化）
从哪里获得：能否接受从包涵体中获得蛋白（含复性）
标签：His tag 为主（N端或C端）；GST，MBP，Trx，Flag tag等
是否酶切：是否需要酶切，接受残留氨基酸
内毒素要求：1EU/ug，0.1EU/ug等
最后Storage buffer：有没有具体buffer，常用Tris，PB 加NaCl，甘油。

复性的蛋
白有可能加入L-arginine或detergent
发货要求：液体或冻干粉
能否提供文献参考：protocol等
蛋白用作什么用途：结晶，抗体等。

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。

取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。

直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。

2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

重组人IL-4中文说明书

重组人IL-4中文说明书

重组人白细胞介素4说明书产品名称通用名称：重组人白细胞介素4英文名称：Recombinant Human Interleukin 4（rhIL-4）适用范围用于DC细胞体外培养，适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。

若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。

同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。

CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。

细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表达CD14。

使用说明推荐使用浓度为1000IU/ml。

如需分装，可用注射用水、生理盐水、培养基或PBS稀释，稀释后浓度保持在100ug/mL以上。

稀释后置于-20℃保存期6个月，-80℃保存期12个月。

参考文献1、Banchereau J1, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B, Palucka K.Immunobiology of dendriticcells.《Annual Review of Immunology》, 2000, 18(1):767-8112、J, Banchereau，RM Steinman，Dendritic cells and the control of immunity. 《Nature》, 1998, 392(6673):245-2523、G Schuler Dendritic cells in cancer immunotherapy 《European Journal of Immunology》, 2010, 40(8):2123-30。