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质粒转化⼤肠杆菌实习报告--附实验图⽚细胞转基因技术研究进展1实验内容：原核细胞转基因:⼤肠杆菌感受态细胞的制备, 转化和鉴定2实验原理及技术介绍：细菌质粒是⼀类双链、闭环的DNA，⼤⼩范围从1kb⾄200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独⽴于细胞染⾊体之外的⾃主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染⾊体外的游离状态，但在⼀定条件下也会可逆地整合到寄主染⾊体上，随着染⾊体的复制⽽复制，并通过细胞分裂传递到后代。
但是在⾃然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作⽤转移到新的宿主内,但在⼈⼯构建的质粒载体中,⼀般不能⾃⾏完成从⼀个细胞到另⼀个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产⽣⼀种短暂的感受态以摄取外源DNA。
所谓感受态，是指细菌⽣长过程中的某⼀阶段的培养物，只有某⼀⽣长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA ⽽不将其降解的⽣理状态。
感受态形成后，细胞⽣理状态会发⽣改变，出现各种蛋⽩质和酶，负责供体DNA的结合和加⼯等。
细胞表⾯正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分⼦的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引⼊⼤肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分⼦的感受态细胞。
在细菌中，能发⽣感受态细胞是占极少数。
⽽且，细菌的感受态是在短暂时间内发⽣。
⽬前对感受态细胞能接受外来DNA分⼦的本质看法不⼀。
主要有两种假说:⼀种是局部原⽣质体化假说——细胞表⾯的细胞壁结构发⽣变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分⼦能通过质膜进细胞。
另⼀种是酶受体假说——感受态细胞的表⾯形成⼀种能接受DNA的酶位点，使DNA分⼦能进⼊细胞。
本实验通过CaCl2对特定的⼤肠杆菌处理，制备感受态的细菌。
这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如⼀些插⼊⽬的DNA ⽚段的重组质粒，产⽣5×106~2×107个转化的菌落。
当质粒与这些⼤肠杆菌混合后，质粒粘附在⼤肠杆菌的表⾯，在42℃的温度时，⼤肠杆菌出现热休克，质粒可通过⼤肠杆菌细胞膜上形成的空隙进⼊菌体内。
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
重组质粒DNA转化大肠杆菌一、目的掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。
二、概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
三、材料及试剂（一）、材料1.外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知。
2.载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知。
3.宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
1.设备2.恒温摇床3.台式高速离心机4.恒温水浴锅5.琼脂糖凝胶电泳装置6.电热恒温培养箱7.电泳仪无菌8.工作台9.微量移液枪10.eppendorf管（二）、试剂1.LB固体和液体培养基2.T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3.X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4.IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
5.含AmpLB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
