重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化

1. 概述

表 1 重组蛋白不一致表达策略的优点与缺点

表达策略 优点 缺点

分泌表达至细胞外 增强正确二硫键的形成

降低蛋白酶对表达蛋白的降解

可获得确定的N末端

显著减少杂蛋白水平，简化纯化

不需要细胞破碎 表达水平低

多数蛋白不能进行分泌表达

表达蛋白需要进行浓缩

细胞周质空间表达 增强正确二硫键的形成

可获得确定的N末端

显著减少杂蛋白水平，简化纯化 好些蛋白不能分泌进入周质空间

没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术

周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解

胞内包涵体表达 包涵体易于分离

保护蛋白质不被降解

蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平 需要体外的折叠与溶解，得率较低

具有不确定N末端

胞内可溶性蛋白表达 不需要体外溶解与折叠

通常具有正确的结构与功能 高水平的表达常难以得到

需要复杂的纯化

可发生蛋白质的酶解

具有不确定的N末端

在 细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各类性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定 的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。因此蛋白质的分离纯化能够看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集 于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，关于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性与稳固性的要求，关于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度与得率之间进行一个平衡，所下列游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。

蛋 白质的功能依靠于蛋白质的结构，关于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中务必根据目标蛋白的特点，使用合适的操作条件与方法，保证目标蛋白的活性尽量不 缺失。除了在分离纯化的初期，要使用快速的方法除去影响目标蛋白稳固性的杂质，还要严格操纵涉及蛋白质变性的各类因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构 象稳固性能够通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）与去折叠（u）间自由能的变化（ΔGf→u）来衡量，ΔGf→u越大蛋白质就越稳固。根据报导蛋白质的ΔGf→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔGf→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳固一点，因此务必克服蛋白质内在的不稳固性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化与蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳固性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。

在 进行任何纯化工作时，第一步务必针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性 （如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏与可定量的特点。特异性要求分析方法反 映目标蛋白的特殊性，以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性与定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给 操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步，都需要对蛋白与活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或者目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Western blotting就 能够从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一 些免疫学的方法进行检测。在纯化的过程中，需要监测下列几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就能够跟踪每 步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，与纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包含了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹与酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，因此有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。

1. 分离纯化的方法策略及其应用

下 游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或者酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体与沉淀 物，可选择离心或者过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或者超滤；另一方面，设计的纯化工艺包含特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。吸 附层析，如离子交换层析，疏水层析与亲与层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除 少量的杂蛋白或者聚合体，在纯化过程中用于脱盐与缓冲液交换。在分离纯化中对每个步骤的选择，能够遵循下列原则：1 应尽可能的利用蛋白质的不一致物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不 同的蛋白质在性质上有很大的不一致，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的根据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白与杂质成分物理性质的差异。因此在分 离纯化的开始阶段，要尽可能的熟悉目标蛋白的特性，不仅如此还要熟悉所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且酸性蛋白较多；3 在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4 在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是由于处理的量与杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。

在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率与处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1 所示。在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白与细胞内的DNA、RNA、 多糖与性质差别较大的蛋白质成分分离，使用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳固性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获与浓缩。在这 一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析与疏水层析具有操作上的优点，能够再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中 间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到与大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不一致的性质选择不一致的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质 的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。关于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤与方法与可 溶性蛋白不一致，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。

图1 经典的蛋白质纯化流程图

2.1 包涵体蛋白质的折叠复性

在过去几十年的进展过程中，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径，尽管有不一致的宿主系统可供选择，假如翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话，大肠杆菌与其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选(17)。细菌如大肠杆菌能够在短时间里得到高水平表达的蛋白质，但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依靠于蛋白质的折叠速率与聚集速率，同时与蛋白质的合成与降解程度有关（35）。 强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依靠于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特 性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，由于有些 蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成 错配的二硫键，这常常是包涵体形成的要紧原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或者对细胞的毒性作用使得表达水平极低 （45）。蛋白质的糖基化能够影响到蛋白质的折叠行为与溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。

在包涵体蛋白质的变复性中，不管是使用什么方法进行折叠，都要用变性剂溶解包涵体，最终又都要去除变性剂，懂得变性剂对蛋白质的影响能够指导我们设计复性过程。

图2：在各类变性剂浓度条件下蛋白质的溶解性与构象。

通常从包涵体中回收活性蛋白质包含三个步骤：包涵体的分离与洗涤，包涵体蛋白质的溶解与溶解蛋白质的再折叠。前两个步骤效率较高，但是再折叠的效率率常常不能令人满意，折叠的方法与折叠的条件需要通过实验来进行筛选。

2.1.1 蛋白质折叠的过程与机理

对蛋白质折叠机理的研究，对保留蛋白质活性，维持蛋白质稳固性与包涵体蛋白质折叠复性都具有重要的意义(21)。早在上世纪30年代，我国生化界先驱吴宪教授就对蛋白质的变性作用进行了阐释（8），30年后，Anfinsen通过对核糖核酸酶A的经典研究说明去折叠的蛋白质在体外能够自发的进行再折叠，仅仅是序列本身已经包含了蛋白质正确折叠的所有信息（9,10），并提出蛋白质折叠的热力学假说，为此Anfinsen获得1972年诺贝尔化学奖。这一理论有两个关键点：1蛋白质的状态处于去折叠与天然构象的平衡中；2 天 然构象的蛋白质处于热力学最低的能量状态。尽管蛋白质的氨基酸序列在蛋白质的正确折叠中起着核心的作用，各类各样的因素，包含信号序列，辅助因子，分子伴 侣，环境条件，均会影响蛋白质的折叠，新生蛋白质折叠并组装成有功能的蛋白质，并非都是自发的，在多数情况下是需要其它蛋白质的帮助，已经鉴定了许多参与 蛋白质折叠的折叠酶与分子伴侣（3,16,86）， 蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变与更新，但这并不与折叠的热力学假说相矛盾，而是在动力学上完善了热力学观点。在蛋白质的折叠过程中，有许多作用 力参与，包含一些构象的空间阻碍，范德华力，氢键的相互作用，疏水效应，离子相互作用，多肽与周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠（12,52），但关于蛋白质获得天然结构这一复杂过程的特异性，我们还知之甚少，许多实验与理论的工作都在加深我们对折叠的认识，但是问题仍然没有解决。

图 3：能量图景（The energy landscape）的示意图，高度代表能量尺度，宽度代表构象尺度，在漏斗（funnel）的下方存在别的低能量状态，共存的不一致能量状态的蛋白质种类也降到最小(14)。

2.1.2 包涵体的分离与溶解

分 离包涵体的第一步是对细菌进行最大限度的溶解，将几种细胞破碎技术相结合，如联合使用溶菌酶处理，高压匀浆细胞破碎与含表面活性剂的高盐溶液处理，能够使 膜碎片与细胞壁碎片最大限度的分解。细胞破碎后，通过离心的方法能够很方便的回收包涵体，再用洗涤液（通常含有低浓度的变性剂，表面活性剂，还原剂，EDTA）对包涵体进行清洗，就能够得到较纯的包涵体（4，74）。通常要选用强的变性剂使蛋白质完全变性溶解，如6 M的盐酸胍与8 M 的尿素，蛋白质浓度多使用1-10mg/ml（22）。由于盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强，而且尿素中的异氰酸酯能够使自由氨基氨甲酰化（这种作用在碱性条件下表现的更强），因此常常首选盐酸胍作为解离剂。对含有分子间二硫键或者非天然二硫键的包涵体蛋白质，在溶解过程中需要加入还原剂，如二硫苏糖醇，β-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，加入螯与剂，如EDTA，能够防止金属催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改变pH与使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质（22），相对而言，这两种方法的应用较少，而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才能够用表面活性剂进行溶解，否则可同时形成正确的与非正确的二硫键，说明用尿素、盐酸胍变性与用表面活性剂变性对蛋白质的结构与动力学有不一致的影响，Tsumoto在这方面做了全面的论述（25）。