分离纯化蛋白质的方法及原理
（一）利用分子大小
1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行
涉及的问题：
如何加快透析过程
（1） 加大浓度差，及时更换透析液
（2） 利用磁力搅拌器
常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成
2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上
3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来
（二）利用溶解度差别
4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同
6、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力 （2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用
蛋白质的分离纯化
1.溶菌酶活性的测定
采用浊度法,用60mmol／L、pH6．2的磷酸缓冲液配制一定浊度0450--0．6"-'0．7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0．1mL酶液加入2．5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以△彳45dmin变化0．001个吸光度值为一个活性单位。
酶活力=△450nm／lminx0．001 x0．1mL
式中：△450nm--lmin内吸光度的变化
2.阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定
3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
4.作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后，确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。
5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：
（1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD)
6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150
8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90
10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80
12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD)
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法
离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法
电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法
层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法
亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
四种蛋白纯化方法
1. 溶液沉淀法
溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。
步骤：
1. 样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2. 溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。
3. 沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
4. 溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。
优点：
• 简单易行，不需要复杂的设备和操作。
• 适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。
缺点：
• 可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。
• 沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。
2. 凝胶过滤法
凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。
步骤：
1. 样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2. 凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。
3. 样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。 4. 蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。
5. 收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。
优点：
• 可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。
• 纯化后的蛋白质纯度较高。
缺点：
• 操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。
• 只适用于分子量差异较大的目标蛋白。
3. 亲和层析法
亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。
