免疫学试验课沉淀反应

免疫学和免疫学检验：沉淀反应沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。

早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。

早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应。

1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行。

Oudin（1946）报告了试管免疫扩散技术，Mancini（1965）提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展。

另一方面，免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。

沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物（参见第九章）。

经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法；而快速免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。

现代免疫技术（如各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术。

第一节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验为历史较久，又较有用的方法。

该法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。

这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。

（一）抗原稀释法抗原稀释法（Dean-Webb法）是将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或37℃反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。

表12-1系以牛血清白蛋白为例的实验结果。

表12-1Dean-Webb定量沉淀试验管号抗原抗体总沉淀量反应过剩物抗原沉淀量抗体沉淀量沉淀中Ab/Ag1 0.003 0.68 0.093 Ab 0.003 0.090 30.02 0.005 0.68 0.145 Ab 0.005 0.140 28.03 0.011 0.68 0.249 Ab 0.011 0.238 21.74 0.021 0.68 0.422 Ab 0.021 0.401 19.15 0.032 0.68 0.571 Ab 0.032 0.539 16.86 0.043 0.68 0.734 － 0.043 0.691 16.17 0.064 0.68 0.720 Ab －－－8 0.085 0.68 0.601 Ag －－－9 0.171 0.68 0.464 Ag －－－10 0.341 0.68 0.368 Ag －－－单位：mmol/L 从表12-1可以看出，1～5管为抗体过剩管，7～10管为抗原过剩管，唯第6管沉淀物最多，两者之比为16:1，即最适比。

医学免疫学沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握沉淀反应的基本原理和操作方法。

2、熟悉琼脂扩散试验和免疫比浊法的应用。

3、观察沉淀反应的结果，理解抗原抗体反应的特异性和定量关系。

二、实验原理沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下结合，形成肉眼可见的沉淀物的反应。

根据反应介质和检测方法的不同，沉淀反应可分为液相沉淀反应和凝胶内沉淀反应。

液相沉淀反应包括絮状沉淀试验和免疫浊度测定。

絮状沉淀试验是将抗原和抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成絮状沉淀物。

免疫浊度测定则是通过测量溶液中抗原抗体复合物形成导致的浊度变化，来定量检测抗原或抗体的含量。

凝胶内沉淀反应常用的是琼脂扩散试验，包括单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。

单向琼脂扩散试验是将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，制成琼脂板，然后在板上打孔，加入抗原，抗原在凝胶中向四周扩散，与抗体形成沉淀环。

沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可通过测量沉淀环的直径来计算抗原的含量。

双向琼脂扩散试验是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的不同孔中，两者在凝胶中扩散，形成沉淀线，用于检测抗原和抗体的特异性以及它们之间的相对分子量。

三、实验材料1、试剂抗原：人血清白蛋白（HSA）、羊抗人血清白蛋白抗体（抗HSA）。

生理盐水。

琼脂糖。

巴比妥缓冲液。

2、器材载玻片。

打孔器。

移液器。

分光光度计。

四、实验步骤（一）絮状沉淀试验1、取两支试管，分别标记为“抗原管”和“对照管”。

2、在“抗原管”中加入 05ml 抗原溶液（HSA），在“对照管”中加入05ml 生理盐水。

3、向两支试管中分别加入05ml 抗体溶液（抗HSA），轻轻摇匀。

4、室温放置 10-20 分钟，观察两支试管中溶液的变化。

（二）单向琼脂扩散试验1、制备琼脂板：称取一定量的琼脂糖，加入巴比妥缓冲液，加热溶解，制成 1%的琼脂糖溶液。

将溶液倒入载玻片上，使其均匀铺开，形成厚度约 2-3mm 的琼脂板，待琼脂凝固后打孔。

沉淀反应沉淀反应蛋白质、多糖、毒素等可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合，出现的沉淀现象，称为沉淀反应。

沉淀反应的特点液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫电泳技术沉淀反应的特点差异凝集反应沉淀反应抗原性质颗粒性抗原可溶性抗原反应时间数分钟数小时反应产物凝集物沉淀物敏感性高低液体内沉淀试验受抗原抗体比例的影响非常明显，常用作测定抗原抗体的最适比例。

有抗原稀释法、抗体稀释法和棋盘滴定法。

免疫浊度测定应用抗原、抗体在液相中反应后形成的免疫复合物微粒对光线的干扰，利用仪器进行定量检测的一种方法。

在一定范围内，吸光度与免疫复合物的量呈正相关。

免疫浊度测定的影响因素1.抗原抗体比例当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。

2.抗体的质量要求：抗体的特异性强、效价高、亲和力强。

R型＞H型。

3.抗原抗体反应的溶液pH6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。

4.增浊剂聚乙二醇（PEG）、吐温-20，可消除抗原或抗体分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。

免疫比浊方法分类透射和散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法凝胶内沉淀试验单向免疫扩散试验Mancini曲线：适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果；公式：c／d2＝k。

Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（＜24h）扩散的结果处理，用半对数纸画线。

公式：logc／d＝k。

双向免疫扩散试验免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。

1.加快了反应速度2.集中了扩散方向3.分开了不同的蛋白火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳免疫固定电流模式图沉淀反应在医学检验中的应用方法评价应用经典沉淀反应操作繁琐、敏感度低、精密度差、时间长和难以自动化逐渐减少【习题】下列哪项不是沉淀反应的特点A.其特性与经典抗原抗体反应相同B.抗原是可溶性抗原C.反应可分为两个阶段D.抗体是McAbE.需一定电解质『正确答案』D『答案解析』沉淀反应抗体不是单克隆抗体。

医学免疫学实验指导：沉淀反应【内容】六、环状沉淀试验七、单向免疫扩散试验八、双向免疫扩散试验九、对流免疫电泳试验十、火箭免疫电泳试验十一、免疫电泳试验可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

可溶性抗原与相应抗体相比，抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。

试验、环状沉淀试验（Ring precipitation test）将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。

如抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白色沉淀环。

此试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性等。

【材料】1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。

2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。

【方法】1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。

用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于管底。

2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两层液体之间有一明显的交界面。

3、室温下静置10~20分钟，观察结果。

【结果】观察各管两层液体交界面有无白色沉淀环出现，有白色沉淀环的为阳性。

（图4—5）【注意事项】加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。

试验、单向免疫扩散试验（Single immunodiffusion test）此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。

试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。

在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。

医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的领域中，沉淀反应是一项十分重要的实验技术。

它不仅有助于我们对疾病的诊断和监测，还在科研领域发挥着关键作用。

沉淀反应的原理其实并不复杂。

简单来说，就是当可溶性抗原与相应抗体在特定条件下结合时，会形成肉眼可见的沉淀物。

这一过程基于抗原与抗体的特异性结合，只有当两者的结构和电荷相互匹配时，才能发生有效的反应。

沉淀反应的类型多种多样。

其中，环状沉淀反应是比较经典的一种。

在这种反应中，将抗原溶液小心地叠加在抗体溶液之上，在两者的界面处，如果存在对应的抗原抗体，就会形成白色的沉淀环。

这种方法虽然简单直观，但灵敏度相对较低，如今在实际应用中已经不那么常见。

另一种常见的沉淀反应是絮状沉淀反应。

在这个实验中，抗原和抗体溶液混合后，会出现肉眼可见的絮状沉淀物。

然而，这种反应的结果判断往往比较主观，容易受到多种因素的影响，比如溶液的浓度、温度以及混合的方式等。

相较于上述两种方法，免疫比浊法在现代医学中的应用更为广泛。

它通过测量溶液中抗原抗体复合物形成后导致的浊度变化，来定量分析抗原或抗体的含量。

这种方法具有快速、准确、自动化程度高等优点，尤其适用于临床实验室对大量样本的检测。

在实际应用中，沉淀反应有着广泛的用途。

比如在疾病诊断方面，当我们怀疑一个人感染了某种病原体时，可以通过检测患者血清中针对该病原体的特异性抗体来辅助诊断。

如果检测结果显示存在相应的沉淀反应，就提示患者可能已经感染了该病原体。

再比如，在血液制品的质量检测中，沉淀反应可以帮助检测其中是否存在杂质或异常蛋白。

这对于保障血液制品的安全性和有效性至关重要。

不仅如此，沉淀反应在自身免疫性疾病的诊断中也发挥着重要作用。

自身免疫性疾病患者体内常常会产生针对自身组织或细胞的抗体，通过沉淀反应检测这些抗体的存在，可以为疾病的诊断提供有力的依据。

然而，沉淀反应也并非完美无缺。

它可能会受到一些因素的干扰。

比如，标本的采集和处理不当可能会影响抗原或抗体的活性，从而导致假阴性或假阳性结果。

医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的广袤领域中，沉淀反应是一项重要的实验技术，它在疾病的诊断、免疫机制的研究以及生物制品的质量控制等方面发挥着不可或缺的作用。

让我们先来了解一下什么是沉淀反应。

简单来说，沉淀反应是指在溶液中，可溶性抗原与相应抗体特异性结合，形成肉眼可见的沉淀物的现象。

这种反应基于抗原与抗体的结合特性，当它们相遇并结合达到一定比例时，就会形成不溶性的复合物，从而沉淀下来。

沉淀反应有着多种类型，其中比较常见的有环状沉淀反应、絮状沉淀反应以及免疫比浊法等。

环状沉淀反应是一种较为古老但直观的方法。

在这种反应中，将抗原溶液小心地叠加在抗体溶液上，在两液的交界处，如果存在对应的抗原抗体反应，就会形成白色的沉淀环。

这个方法虽然操作简单，但相对来说灵敏度不高，如今在实际应用中已经较少单独使用。

絮状沉淀反应则是将抗原与抗体在试管中混合，通过观察溶液中出现的絮状沉淀来判断反应的结果。

这种方法比环状沉淀反应的灵敏度有所提高，但仍然存在一定的局限性。

而免疫比浊法则是一种更为精确和灵敏的定量检测方法。

它利用抗原抗体结合后形成的复合物会导致溶液浊度的变化，通过仪器测量浊度的变化来确定抗原或抗体的含量。

这种方法在临床检测中应用广泛，比如对血清中免疫球蛋白、补体等成分的定量测定。

那么，沉淀反应在医学领域中具体有哪些应用呢？首先，在疾病诊断方面，沉淀反应具有重要的价值。

例如，对于某些传染病的诊断，通过检测患者血清中特定病原体的抗体，可以判断患者是否曾经感染过该病原体。

比如，梅毒的诊断就可以利用沉淀反应检测患者血清中的梅毒螺旋体抗体。

其次，在自身免疫性疾病的诊断中，沉淀反应也发挥着关键作用。

像系统性红斑狼疮等疾病，通过检测患者血清中的自身抗体，如抗核抗体等，可以为疾病的诊断提供重要依据。

此外，沉淀反应还用于监测疾病的进展和治疗效果。

例如，在肿瘤治疗中，通过定期检测患者血清中肿瘤标志物的含量变化，可以评估治疗方案的有效性。

第六章沉淀反应第一节沉淀反应的特点沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。

沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。

沉淀反应分两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。

第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。

（一）抗原稀释法（二）抗体稀释法（三）方阵滴定法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。

抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。

方阵滴定法即棋盘滴定法二、免疫浊度测定免疫浊度测定本质上属于液体内沉淀反应。

将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应。

可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。

（一）免疫比浊测定的影响因素1、抗原抗体的比例抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素，当抗原和抗体的比例适当时，二者全部结合，既无过剩的抗原，也无过剩的抗体。

当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。

当抗原过量时，形成的IC（免疫复合物）分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。

2、抗体的质量免疫比浊测定法要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强，并使用R型抗体。

3、抗原抗体反应的溶液抗原抗体反应液的最适pH为6.5～8.5。

一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。

4、增浊剂某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。

（二）抗体稀释法1、透射免疫比浊法。

第六章沉淀反应本章考点1.概念2.液相内沉淀反应3.凝胶内沉淀反应4.免疫浊度法概念：沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。

第一节沉淀反应的特点1.沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。

2.沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成。

如沉淀线、沉淀环。

图19 两种抗血清形成的沉淀带第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此产生最适比例的测定方法，常见有：1.抗原稀释法：抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。

2.抗体稀释法：抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。

3.为了保证抗原抗体在最适比例条件下进行反应，达到最大沉淀反应的效果，就必须对抗原和抗体最佳工作浓度做出选择。

将上述我们讲过的抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法，又称为棋盘格法。

从上表中可以看出，Ab用1：40稀释时，Ag则应按1：320稀释；反之，Ag按1：160稀释，则Ab应按1：20稀释。

又如在进行ELISA试验时，反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件，同样需要采用方阵滴定法进行实验找出抗原和抗体最佳稀释度。

二、免疫浊度法免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。

（一）免疫浊度法原理当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。