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高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率溶解曲线分析概述高分辨率溶解曲线分析是一种广泛应用于生物学领域的分析技术，特别适用于检测基因表达、基因多态性、SNP位点以及DNA结构等。
该技术通过对双链DNA在不同温度下的解离曲线进行测定和分析，可以用来定量评估样品中特定序列的数量和质量。
原理高分辨率溶解曲线分析的原理基于PCR扩增反应后的DNA解离动力学。
在PCR扩增过程中，双链DNA会在高温下解开成两条单链DNA。
随后，在降温过程中，两条单链DNA会重新结合形成双链DNA。
在这个过程中，如果样品中存在特定的序列差异（如基因多态性或SNP位点），它们的解离和结合过程会发生略微的差异，这些差异可以通过溶解曲线分析来检测和分析。
溶解曲线分析一般通过添加DNA染料（如SYBR Green）来实现，该染料可与DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应后，样品中的DNA会逐渐增加，溶解荧光信号也会随之增强。
在降温过程中，不同的PCR产物的解离过程会导致荧光信号发生变化。
通过监测溶解曲线上的荧光信号强度，可以得到不同PCR产物的解离温度，进而从中推断样品中的目标序列的数量和质量。
实验步骤高分辨率溶解曲线分析通常包含以下几个步骤：1.PCR扩增反应：根据需要扩增的目标序列设计引物，并进行PCR扩增反应。
PCR反应体系中添加SYBR Green或其他DNA染料。
2.热变性：PCR扩增反应后，将样品在高温下进行变性，通常为95°C。
3.降温：将样品温度降低到特定的温度范围，通常为60-95°C，并持续监测荧光信号的强度。
4.溶解曲线分析：根据荧光信号强度和温度的变化关系，绘制溶解曲线图。
通过比较样品中特定序列的解离温度，可以评估目标序列的数量和质量。
5.数据分析：根据溶解曲线图，可以使用特定的软件或算法对数据进行定量分析。
常见的分析方法包括计算解离温度、判断PCR产物的品质以及定量评估样品中的目标序列含量。
应用高分辨率溶解曲线分析在生物学研究中有广泛的应用。
基因芯片和高分辨率熔解曲线在结核分枝杆菌检测中的应用分
析
龙丽娟;张冬青;赵娇(综述);王海滨(审校)
【期刊名称】《检验医学与临床》
【年(卷),期】2022(19)12
【摘要】结核病是人类尚未克服的难题,近年来,越来越多耐药菌株的出现更加引起了人们对结核病的重视。
目前结核分枝杆菌最常用的检测方法为抗酸染色和罗氏培养法,这些方法虽然成本低廉,但灵敏度低,对结核病的诊断不够及时、灵敏,不能满足临床对结核病诊治的需求。
传统的PCR技术不能对结核分枝杆菌进行分型和耐药性检测,后续仍需进行复杂的生化实验。
而基因芯片技术和高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术从基因的角度出发,在菌种鉴定和耐药性检测上都更直接地反映待测标本的菌株信息,两者因其检测速度快、特异度高而引起了广泛关注,本文就二者在结核分枝杆菌检测中的应用进行对比分析。
【总页数】3页(P1716-1718)
【作者】龙丽娟;张冬青;赵娇(综述);王海滨(审校)
【作者单位】解放军总医院第四医学中心检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
【相关文献】
1.高分辨率熔解曲线分析技术在检测非小细胞肺癌组织和血清EGFR基因突变中的应用
2.高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测
3.高分辨率熔解曲线分析技术在检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变中的应用
4.高分辨率熔解曲线对痰液中结核分枝杆菌耐药性分析
5.荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用
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高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：∙检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁∙鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变∙基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失∙特定突变、多态性位点的筛选∙外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：∙灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。
在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。
方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。
样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。
除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。
在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。
结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。
发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。
我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。
用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。
我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。
结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。
在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。
stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。
self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。
弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。
依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。
蝎子引物5’端复杂延伸，包括一个探针元素，一对自己互补的茎干序列，一个荧光基团，一个淬光剂，一个阻止5’端延伸复制的拦截单体。
在分子内，蝎子比分子信标有些优势，因为杂交是快速的，且没有限制比率，与最快的PCR protocols 相同。
通过分子内的反应，发夹结构比较稳定，增加了5-15℃的熔解温度，这样的话序列变化比较高的时候，也可以分析比较短的范围。
此外，只需要2个寡核苷酸链，其中一个即作为引物又作为探针。
分子信标和蝎子引物是有独创性的方法，可以用于基因分型和real-time PCR，但是设计时比较复杂，合成及纯化限制了他们的应用。
代替共价修饰探针，在与DNA双链结合的情况下发出荧光的DNA染料可以用于real-time PCR和闭管操作基因型。
SYBR Green Ⅰ是普遍使用的，通过熔解分析可以增加特异性。
现在引入的高分辨率熔解曲线技术使得染料分析法变得比较有吸引力。
发明的新的染料可以将PCR产物中的异源双链核酸分子可靠的检测出，而且高分辨率熔解曲线分析仪器也已经出现。
熔解曲线的特异性探针分型是可能的，此方法用的是LC Green Plus和非标记探针，非标记探针是3’端封闭，阻止延伸。
合并非标记探针为弹回引物，弹回探针的优点是self-probing扩增避免了特殊共价修饰的费用及其复杂性。
方法与材料DNA样品PCR模板包括M13序列的工程质粒和人类基因组DNA。
在同一位置分别为A、C、G或T的其他相同的质粒由Lonza Rockland公司提供。
我们通过A260处的吸光度确定质粒的浓度，假定1.0的A260是50mg/L。
我们把相同摩尔数的质粒混合形成单个碱基的杂合子。
我们从提交到相关区域和大学病理学家的在MagNA Pure LC (Roche)基因分型F5（凝固因子5）的100个人类血样中提取DNA。
DNA的浓度没有定量，但是范围是20-40ng/L。
这些样品通过全球ARUP protocol（IRB 7275）分离确定F5 1691G>A 位点的基因型。
我们从Coriell医学研究所获得已知CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节因子）突变的样品。
引物由犹他大学核心合成设施合成，用Trityl-ON 圆柱净化弹回引物。
PCR引物的序列，PCR产物和环的长度及双重的发夹结构见补充表1，伴随着这篇文章的在线版本：/content/vol54/issue10。
PCR和溶解曲线的采集PCR体系为10ul，模板为质粒，包含50mmol/L Tris、500mg/L牛血清蛋白，3 mmol/LMgCl2，200 umol/L脱氧三磷酸核苷，0.4单位的Klen Taq酶（AB Peptides），88ng的TaqStart 抗体（Clontech），0.5x LC Green Plus（Idaho Technology），0.5umol/L弹回引物，0.05umol/L的限制引物，106拷贝的质粒。
在LightCycler （Roche）做PCR，45个循环，95℃变性（0s），退火50℃（0s），之后以2℃/s的速率至延伸温度72℃，在72℃的时候停留8s钟。
PCR反应之后，毛细管样品变性94℃（0s），之后冷却到40℃。
温度转化速率为20℃/s，除非另作说明。
将样品从LightCycler移至高分辨率熔解仪器HR-1（Idaho Technology）,以0.3℃/s熔解。
我们按照上述的PCR条件扩增人类基因组DNA，下述除外。
微量滴定板用于PCR，模板浓度（F5）是2-4mg/ml，5mg/ml（CFTR）。
CFTR扩增是对称的，引物的加入量是0.5umol/L，反应体系为10ul（F5，384板）或者2ul（CFTR，96孔板），覆盖矿物油（Sigma）10-15ul，1500g离心3-5min，在PTC-200 PCR仪（Bio-Rad）上做PCR。
最初的变性温度是95℃3min，之后是95℃20s，58℃15s，72℃20s，40个循环（F5）；95℃15s，55℃10s，72℃15s（CFTR）。
PCR之后，用水稀释PCR产物（18ul每孔，10倍稀释），离心，在Lightscanner中加热至95℃，之后将样品拿出仪器，室温冷却至<40℃。
在熔解之前，离心所有的板子，之后在96或384的Lightscanner仪器上采集荧光信号，加热速率是0.15℃/s。
熔解曲线分析用定制软件或商业的LightScanner软件分析方法分析熔解曲线结果。
简略的说，在0%-100%标准化熔解曲线，减去指数背景，熔解曲线以与温度相对应的荧光信号的一阶导数点的形式显示。
结果图1显示的是弹回引物基因分型的原理图。
弹回引物包括5’端的尾巴，与其延伸的产物互补。
不对称PCR之后，形成分子内的发夹结构和分子间的扩增子的双链。
在饱和荧光染料存在的条件下，可以在与温度相对应的荧光信号的一阶导数熔解图上观察到弹回产物和扩增子产物的熔解峰。
发夹结构茎部的序列变化改变弹回图1：弹回引物和饱和DNA染料进行基因分型。
弹回引物是标准的寡核苷酸，在5’端包括一个探针元素与引物的延伸产物互补。
加入过量的弹回引物，做不对称PCR。
冷却过程，形成全长的扩增子以及过量的弹回链形成分子内的发夹结构。
熔解显示低温（弹回发夹）和高温（全长扩增子）过渡，指数背景减去了没有合并的引物的非特异性荧光。
探针元素的熔解提供了目的基因分型，然而扩增子的高分辨率熔解曲线分析随机的检测扩增子之内的变化。
双链的Tm值，允许通过熔解分析进行基因分型，与非标记探针法基因分型相似。
因物件的变化也会改变扩增子的熔解，可以用于突变扫描。
发夹结构和扩增子双链的相关数量可以通过限制引物的浓度及循环数调整。
弹回引物5’末端包括2bp的错配，阻止限制引物扩增的全长单链发夹结构3’端的延伸。
这增加了不对称PCR扩增的效率，增加了相对于扩增子的发夹结构的信号。
通过确定的质粒做PCR研究发夹结构环的大小，茎的长度及茎中单个碱基的错配。
图2显示的是用同样的发夹茎，发夹换和扩增子大小的效果。
扩增子增加了长度，其Tm值也随着增加了。
但是，随着扩增子和发夹环的增加，发夹结构的Tm值减少。
比较短的环导致比较稳定的发夹，在17-135bp的范围内显示定量的关系。
与相同序列非标记探针对比，弹回引物有34base的环，增加了大约10度的Tm值（数据没有显示）。
发夹结构与扩增子相比的荧光信号在扩增子长度为120bp时最大。
扩增子越长，发夹结构的荧光信号减少，特别是300bp以上。
图3A显示的是弹回茎部长度的Tm值的效果。
茎部与扩增子的相对荧光信号强度大于图2。
因为弹回引物5’端末端包含了2bp的错配，阻止次要的弹回产物的延伸。
茎的长度变化为8-20bp，和扩增子及环的长度有最小的变化。
惊奇的是，虽然8bp双链的长度小于20bp双链长度的一半。
但是，8bp的双链的信号与20bp双链的荧光信号相似。
补充图1显示扩展研究扩增子长度的为6-28bp。
Tm值与双链长度显示线性相关。
用12或20bp的双链区分杂合子和纯合子，比较容易区分杂合子（图3b）。
A:C错配的杂合子减少发夹结构的Tm值6-8℃。
图4证实的是弹回引物区分同一位置单个碱基变化的能力。
图4A显示的是不同的纯合子的对比。
完全配对的发夹结构（A:T）比A:G，A:A，A:C错配稳定。
此外，所有的杂合子可以容易的识别和分离（图4B）。
突变在茎的三分之一的单个碱基的基因型是最好区分的，突变在茎的末尾一般检测不到（没有显示）。
图2：不对称PCR之后弹回引物熔解环的效果通过一个普通的24bp探针元素，针对同一目标位点设计弹回引物在不同间距退火。
PCR产物的范围是102至322bp，Tm值变化范围为80-84℃，发夹环的长度为17-236bp。
显示的是全部的熔解曲线，包括发夹结构和扩增子的熔解图，其中发夹结构环的长度为17b（最粗的黑线），34b（较粗的黑线），88b（较细的黑线），135b（最粗的灰线），177b（较粗的灰线），236b（较细的灰线）。
曲线经过标准化，去除了指数背景，显示与温度相对应的荧光信号的一阶导数图。
发夹结构的Tm值随着环大小的增加而减少。
所有发夹结构双链的长度是24b，除了135b的环额外的互补成25bp的双链。
通过临近预测，不考虑环或最终错配的效果的方法校正25bp双链（水平线）的观测Tm值，稳定额外的碱基对。
环的大小17-135b显示的是对数线性关系。
图5和图6显示的是人类基因组DNA的弹回基因分型。
图5显示的是F5 1691G>A 在384孔板上对100个以前分过型的样品基因分型的结果。
