高分辨溶解(HRM)分析

high resolution melting analysis -回复高分辨融解分析高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis，简称HRM）是一种快速、灵敏和高通量的核酸序列变异检测技术。

它通过监测核酸序列的熔解曲线形态改变来检测样品中的序列变异。

HRM技术在基因组学研究、遗传学研究以及临床诊断中被广泛应用。

在HRM分析中，样品中的核酸序列首先通过PCR扩增生成多份复制品。

然后，通过升高温度使PCR产物的双链结构断裂，使其变成两个单链结构。

当温度降低时，单链结构会重新组装成双链结构。

在该过程中，不同的核酸序列拥有不同的熔解温度和熔解曲线形状。

为了实现高分辨度融解分析，需要使用专用的荧光染料，能与DNA结合，并且在细微温度变化下发出荧光信号。

常用的荧光染料包括SYBR Green 和Laser Dye。

这些荧光染料的特点是其荧光信号与温度呈现不同的强度和形态。

通过监测这些信号的变化，可以确定PCR产物的融解曲线。

在进行HRM分析之前，首先需要选择合适的引物，以确保特异性扩增。

引物的设计需要避免引物间的相互作用，以及避免引物结合到非特异序列上。

此外，也需要考虑到引物的长度、GC含量和熔解温度。

在进行HRM分析实验时，首先需要对样品中的DNA进行提取和纯化。

然后，通过PCR扩增特定的片段。

扩增反应通常包含引物、DNA模板、核酸酶和聚合酶。

PCR反应温度通常包括一个初始的变性步骤（通常在95C），以打开DNA双链结构，然后是一系列的循环步骤，包括变性、退火和扩增。

在退火步骤中，引物结合到目标DNA上，确定扩增目标。

扩增反应完成后，通过升高温度来实现PCR产物的熔解。

温度升高时，单链DNA会分离并形成两个单链DNA。

熔解过程中，荧光染料的荧光信号会随着温度的增加而增强。

通过监测荧光信号的强度和形态，可以得到PCR产物的熔解曲线。

接下来可以通过HRM分析软件来分析和解释熔解曲线。

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高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。

随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。

毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。

高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。

可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。

HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。

因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。

原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。

高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。

由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。

高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。

它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。

HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。

如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。

随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。

HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。

基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。

所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

high resolution melting analysis -回复什么是高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）？高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）是一种基于DNA的分析技术，用于检测DNA中的序列差异，如突变、多态性等。

它是一种快速、灵敏且经济高效的方法，通常用于基因突变筛查、SNP检测、基因分型等应用。

HRM利用DNA的特性，通过热反应中DNA双链解旋和再结合过程中的温度变化，来测定样品中的DNA序列。

这个过程涉及到将DNA样品在逐渐升高的温度下加热，随后监测染料的强度变化。

在整个过程中，DNA 会在特定融点温度下解旋形成单链DNA，再在高温下结合成双链DNA。

在温度梯度中，样品中的DNA序列相异点（突变、多态性等）会导致其在特定温度下有所不同的解旋和结合行为，从而导致曲线的形态和位置产生变化。

HRM的原理和步骤是什么？在HRM的实验中，需要进行一系列样品预处理、PCR扩增和融解分析。

首先，需要从样品中提取DNA，并对DNA进行质量和浓度的测定。

合适的DNA浓度对于反应的准确性和可靠性至关重要。

其次，进行PCR扩增反应。

在PCR反应中，根据待测序列的特点，选择适当的引物对DNA进行扩增，以增加待测序列（突变、SNP等）的相对丰度。

PCR反应中的温度梯度逐渐升高，使DNA经历一系列变性和重结合过程。

然后，在PCR扩增结束后，立即开始融解分析阶段。

在这个阶段，通过逐渐升高的温度，从低到高，融解PCR产物中的DNA双链结构。

同时，使用特定染料（通常是SYBR Green）来标记DNA，在特定温度下监测染料的荧光强度变化。

根据不同样本的DNA序列差异，特定的融点曲线形态和位置将发生变化。

通过分析融点曲线的形状、峰的位置和强度，可以判断样品中的DNA序列是否存在突变等差异。

HRM的优点和应用领域是什么?HRM具有以下几个优点：1. 高灵敏度和特异性：HRM可以检测到DNA序列中极小的差异，并能够区分相同长度但不同序列的DNA。

高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。

该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。

HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。

在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。

不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。

因此不能用于熔解曲线的检测。

而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。

HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。

HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。

如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。

hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。

它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。

HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。

它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。

HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。

当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。

这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。

HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。

在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。

在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。

在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。

总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。

它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。