高分辨率溶解曲线HRM突变筛查和基因分型系统

高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。

它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。

HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。

如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。

随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。

HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。

基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。

所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。

HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。

其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。

一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。

不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。

HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。

而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。

图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。

这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。

如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。

下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。

以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。

最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。

HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。

随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。

HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。

2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

3.新突变的筛查。

4.甲基化的筛查。

5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

7.法医学鉴定、亲子鉴定。

8.动植物品质相关多态性位点的研究等。

植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。

检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。

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高通量、低本钞票SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲曲折折曲曲折折折折线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直截了当运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。

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HRM原理HRM的要紧原理是依据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲曲折折曲曲折折折折线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度到达对单个碱基差异的区分。

随着高精度PCR仪〔L ightCycler®480和Rotor-Gene6000〕和饱和染料〔LCGreen、EvaGreen等〕的出现，HRM技术的普及使用成为可能。

HRM应用• SNP〔单核苷酸多态性〕的筛查。

•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

•新突变的筛查。

•甲基化的筛查。

•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

• HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

•法医学鉴定、亲子鉴定。

•动植物品质相关多态性位点的研究等。

植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。

检测灵敏性远高于“PCR+测序〞的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。

•特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达100%。

HRM技术发展和应用作者：马自俭来源：《畜牧兽医科学》 2018年第3期摘要：高分辨率溶解曲线技术( HRM)是将饱和荧光染料，荧光探针和实时荧光定量PCR技术的优点进行整合而产生的一种用于检测基因突变位点和进行基因分型的新技术。

高分辨率溶解曲线技术以其成本低，通量高，简便快捷，高灵敏度和高特异性著称。

本文主要介绍HRM技术的研究进展和应用，以期为应用该技术的爱好者做理论参考。

关键词：高分辨率溶解曲线技术(HRM)；原理；发展中图分类号：Q754 文献标识码：B doi：10. 3969/j. issn. 2096-3637. 2018. 03.0251HRM的发展史HRM技术是近几年来新兴起的一种用于检测单核苷酸多态性的诊断技术。

HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作，因此，HRM检测技术深受国内外科研人员的关注并得到广泛的应用。

已经商品化的用于HRM检测的仪器是LightScanner，它是由美国Idaho公司生产的专门用于单核苷酸多态性位点的检测的仪器，可以在5min的时间里检测96或者384个样品进行突变位点的检测。

此外，市场上其他公司的荧光定量PCR仪器也可以完成对突变位点的检测，如伯乐公司和罗氏公司生产的荧光定量PCR仪可以完成对反应产物的突变位点的检测和基因分型。

目前，常用的应用于基因分型的比较准确的方法之一是探针法，但是探针的合成成本比较高，因此，其临床应用也受到极大的限制。

而本文所介绍的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。

2高分辨率溶解曲线技术的原理高分辨率溶解曲线技术的原理非常简单，就是在PCR扩增结束后，另设置一个解链的步骤。

在温度逐渐上升的阶段，DNA双链由于受到热力作用，碱基之间的氢键会逐步打开，在碱基双链解开到一半的时候，会产生一个解链加剧的点，这个关键点的温度就是DNA双链的Tm温度，在DNA双链逐渐打开的过程叫做溶解。

基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术，在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景。

文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别，利用COⅠ序列，在退火温度为60 ℃，45个循环数的条件下，建立正品鹿茸药材熔解曲线模型，并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围。

结果表明，鹿茸药材在模板DNA质量浓度为10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1，Mg2+浓度 2.0 mmol·L-1的条件下，梅花鹿熔解曲线为双峰，其Tm分别为（81.96±0.07），（84.51±0.03）℃;马鹿熔解曲线为双峰，其Tm为（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃。

该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定。

标签：高分辨熔解曲线;鹿茸药材;分子鉴定Molecular identification of hairy antler by analysis of high resolution meltingCHEN Kang1，2，JIANG Chao1，YUAN Yuan1*，HUANG Lu-qi1，JIN Yan1（1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2. Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）[Abstract]High resolution melting （HRM），an important technology for genotyping and mutation scanning，has broad prospects in the authenticity of traditional Chinese medicine. This paper selected universal COⅠprimers and used HRM to establish a new method for authenticity of Hairy Antler. PCR was conducted at the annealing temperature of 60 ℃and 45 cycles. The range of the DNA template concentration，the primer concentration and the Mg2+ ion concentration were further optimized. The results showed that the Tm values of Cervus nippon were （81.96±0.07），（84.51±0.03）℃and Cervus elaphus was（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃with 10-100 mg·L-1 DNA template，0.2 μmol·L-1 primer，2.0 mmol·L-1 Mg2+. This method can authenticate of hairy antler and is simple，fast，high-throughput，visualization.[Key words]high resolution melting; hairy antler; molecular identificationdoi：10.4268/cjcmm20150409鹿茸始载于《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，能够提高机体工作能力、减轻疲劳，改善睡眠、饮食及蛋白质代谢障碍，增加肾脏利尿功能[1]。

高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。

该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。

HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。

在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。

不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。

因此不能用于熔解曲线的检测。

而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。

HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。

HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。

如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。

高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。

它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。

HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。

实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler® 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。

High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。

本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler® 480，还有常规的离心机、水浴锅等。

HRM 体系配制实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。

先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。

目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。

今天去给大家讲一下两者之间的区别。

（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。

HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。

Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）.两者的采集过程HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。

Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。

（三）.两者的应用HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。

基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。

Real-time：定量及基因分型。

基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。

（四）.基因分型方法的费用HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。

（五）.两者所用的染料HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。

Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。

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高分辨率熔解曲线分析：一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术李东至【摘要】@@ 目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2011(003)002【总页数】3页(P1-3)【作者】李东至【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心,产前诊断中心,广东,广州,510623【正文语种】中文目前，DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法有2种：一是针对特定的位点合成序列特异性探针，如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等，用于检测已知突变；二是以核酸的物理性质为基础的检测方法，如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等，此类方法可用作突变筛查，但无法明确突变性质。

这2种方法在应用上有其局限性，如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。

DNA测序是突变／SNP检测的金标准，但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。

2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变／SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）［1］。

这种技术不受突变碱基位点与类型的限制，可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。

因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注，成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。

高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。

在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。

表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。

Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。

SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。

芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。

Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。

高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。

MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。

检测过程需要多点质控，否则精确度很低。

另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。

应用高分辨熔解曲线技术检测苯丙酮尿症PAH基因突变摘要：目的建立操作简便、快速、成本低、结果准确的鉴定PAH基因外显子突变的基因诊断方法。

方法应用高分辨熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）技术，对山西省已经临床确诊的85例PKU患儿进行外显子突变进行检测，并将检测结果进行测序验证。

结果在受检的山西省患儿中，PAH基因外显子突变位点HRM技术检测结果和测序结果完全相符。

结论高分辨熔解曲线技术操作简便，快速，使用成本低，结果准确，可作为PAH基因外显子突变的快速灵敏检测方法。

关键词：苯丙酮尿症；外显子；高分辨熔解曲线（HRM）技术；突变热点；基因诊断【Abstract】Objective Establish a simple，rapid，inexpensive and sensitive methodfor detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH.Method HRM technology was used to detect mutation in exon in 85 classical type PKU patients and the mutations in all samples were validated by direct sequencing.Results The results detected by HRM is in good agreement with the result obtained by direct sequencing.Conclusion The HRM analysis is a simple，rapid，inexpensive and sensitive method for detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH. 【Key words】phenylketonuria；exon；HRM；Mutational hotspot；Gene Diagnosis 苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。