酶联免疫法原理及操作精品PPT课件

格式：pptx
大小：594.79 KB
文档页数：40

下载文档原格式

酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)

（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，温育，洗涤。（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：

酶联免疫吸附实验ppt课件

作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可做预实验，以确定稀释倍数)。

《酶联免疫分析法》课件

酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制

酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件

6. 酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。

酶联免疫方法的原理及详细操作步骤

不易吸附得非蛋白质抗原可用间接包被得抗原经固相抗体得亲和层析作用,包被在固相上得抗原纯度大大提高,因此含杂质较多得抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素即用亲和素先包被载体,加入生物素化得DNA, 这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质得定量测定。脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。
3、4 洗涤液
在板式ELISA中,常用得稀释液为含0、05%吐温20 磷酸盐缓冲液。
ELISA得试剂准备B
3、2 结合物
即酶标记得抗体(或抗原)就是ELISA中关键得试剂 1 酶得催化活性 2抗体(或抗原)得免疫活性 3含有或少含有游离得抗体(或抗原) 4结合物尚要有良好得稳定性。
3、2、1 结合物用得抗原和抗体
3、 ELISA得试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要得试剂:免疫吸附剂、结合物和酶得底物。 (1)已包被抗原或抗体得固相载体(免疫吸附剂); (2)酶标记得抗原或抗体(结合物); (3)酶得底物; (4)阴性对照品和阳性对照品,参考标准品; (5)结合物及标本得稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液
TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后 ,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为 450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
HRP对氢受体得专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇得过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。
可设计出各种不同类型得检测方法。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

对照标本
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
结果
原理 2.2.6 捕获包被法测抗体
原理 1.1.2 特异性
类型
试剂准备
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
对照标本结果
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
原理
类型试剂准备
对照标本结果
原理 1.1.4 敏感性
类型试剂准备
对照标本
标本（3）酶反应的底物。
结果可设计出各种不同类型的检测方法。
原理 2.2.1 双抗体夹心法测抗原
类型
试剂准备
对照
标本结果
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
原理 2.2.2 双抗原夹心法测抗体
原理
类型试剂准备
对照标本结果
3. ELISA的试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液
原理
类型试剂准备
1.1 抗原抗体反应
1.1.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
对照标本结果
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示： K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。
对照
标本结果
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
原理 2.2.4 竞争法测抗体
类型
试剂准备
对照
标本结果
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
原理 2.2.5 竞争法测抗原
类型试剂准备
化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
结果
原理
类型试剂准备
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可
原理 3.1.2 包被的方式
类型
试剂准备
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量
对照标本
、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
类型试剂准备
对照标本
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
结果
原理 2.2.3 间接法测抗体
类型
试剂准备
原理
类型试剂准备
对照标本结果
ELISA的试剂准备A
固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
结果
原理酶免疫测定类型
类型
试剂准备
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
液相酶免疫测定
对照标本结果
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。
ELISA 知识简介
1
原理
类型试剂准备
对照标本结果
1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备：免疫吸附剂
结合物酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断
原理 1. ELISA的原理
类型试剂准备
对照标本
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
对照检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。标本
结果
原理 2 ELISA的类型
类型
试剂准备
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）；
对照（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
类型
试剂准备
对照标本结果
IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。
原理 2.2.7 ABS-ELISA法
类型试剂准备
对照标本结果
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；