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细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
![一种悬浮驯化293T细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/411d07b682d049649b6648d7c1c708a1284a0a11.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710602248.9(22)申请日 2017.07.21(71)申请人 上海恒润达生生物科技有限公司地址 201210 上海市浦东新区张江路1238弄恒越国际大厦1号楼9楼(72)发明人 黄飞 金涛 王海鹰 何凤 史子啸 (51)Int.Cl.C12N 5/073(2010.01)C12N 5/02(2006.01)(54)发明名称一种悬浮驯化293T细胞的方法(57)摘要本发明提供了一种制备低血清培养的悬浮293T细胞系的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该293T细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的293T细胞，连续培养该293T细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量至血清浓度为0，得到该悬浮培养的293T细胞。
本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。
293T 细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。
293T细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。
权利要求书2页 说明书4页 附图1页CN 109280636 A 2019.01.29C N 109280636A1.全悬浮培养型293T细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：(1)贴壁培养型293T细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，贴壁培养型293T细胞，待细胞生长致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：3比例分瓶传代，置37℃5％CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；(2)低血清贴壁培养型293T细胞系的驯化a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型293T细胞分别用含胎牛血清10％的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5％CO2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成Free style培养基后加10％胎牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中胎牛血清降为5％，按b步骤中的方法，传代比例降为1：3再培养三代；d)培养液中胎牛牛血清降为2％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养三代；传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型293T细胞系；(3)低血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型293T细胞，用Free style无血清培养基按体积比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至2-5×105/ml，125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)重复步骤a)，每培养三代降低血清浓度，胎牛血清浓度依次从2％到1％到0.5％；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型293T细胞系；(4)无血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)在无血清培养基中加0.2％胎牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型293T 细胞直接稀释到密度5×105/ml，置125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml 接种培养，血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型293T细胞系。
哺乳动物細胞體的構造和功能研究方法的發展哺乳动物细胞体构造和功能一直是生物学家们研究的重要课题之一。
随着科学和技术的不断进步，研究方法也在不断地发展和更新。
本文将介绍哺乳动物细胞体的构造及功能，并讨论研究方法的发展情况。
一、哺乳动物细胞体构造哺乳动物细胞体由许多不同的物质组成，包括细胞膜、细胞质、细胞器和细胞核等。
细胞膜是由脂质双层和蛋白质组成的，它包裹着整个细胞，它的主要功能是控制物质在细胞内和细胞外的运输和交换。
细胞质是包含了细胞中的所有物质，它是一个复杂的系统。
细胞质的主要成分是水，同时还包括蛋白质、碳水化合物、核酸、脂类、离子和气体等。
细胞器是内膜系统构成的。
细胞器包括了许多不同类型的器官，包括内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体和膜囊泡等。
每个细胞器都有不同的功能，在维持细胞生命过程中具有重要作用。
细胞核是细胞的控制中心，它包含了遗传信息和基因，参与调节蛋白质合成和细胞分裂等重要过程。
细胞核由核外仁、核孔和染色质组成，核外仁的主要功能是合成核糖体，核孔则是负责物质的运输。
二、哺乳动物细胞体功能哺乳动物细胞体的主要功能是维持生命活动。
不同类型的细胞体具有不同的功能，比如心肌细胞具有收缩功能，神经细胞可以传递信号，肝细胞可参与代谢过程等等。
此外，细胞体还参与许多生物化学过程，例如蛋白质合成、物质分解、分子运输、代谢调节等。
三、哺乳动物细胞体研究方法的发展哺乳动物细胞体的研究方法经历了长期的发展。
在早期，研究人员主要采用组织切片和显微镜技术来观察细胞结构。
由于显微镜的限制，只能观察到细胞中的一些部分结构。
随着科技的不断发展，现代分子生物学技术应用于细胞研究中，例如CRISPR-Cas9基因编辑技术和荧光激活剂等。
CRISPR-Cas9技术用于破坏基因，而荧光激活剂用于启动细胞中特定的分子进程。
此外，高分辨率显微镜也成为细胞研究中的重要工具。
高分辨率显微镜使用高能电子和光线，能够获得更详细的图像，以帮助生物学家了解细胞结构和功能的更多信息。
哺乳动物的克隆方法：胚胎干细胞核移植、胚胎细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。
第一章绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转基因家畜；G. 保护濒危动物。
2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。
第二章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达一、引言在生物制药领域，细胞工程技术被广泛应用于蛋白表达和生物制药制备中。
而293ft细胞悬浮驯化技术的出现，极大地促进了蛋白表达系统的研究和应用。
本文将从悬浮驯化和蛋白表达两个方面，深入探讨293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
二、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞293ft细胞是一种人类胚胎肾细胞，是常用的哺乳动物细胞系，在病毒研究和重组蛋白表达中有广泛的应用。
与传统的293细胞相比，293ft 细胞来源于Flp-In™ 293细胞，其核内含有的FLP重组酶能够特异性地识别FRT位点，并介导外源插入DNA的积极定位，从而提高了外源基因的稳定性和准确性。
2. 悬浮驯化技术悬浮驯化技术是指将细胞种植于搅拌培养皿或生物反应器中，通过搅拌或通气等方式使细胞悬浮在培养基中，从而实现细胞的大规模培养。
而293ft细胞的悬浮驯化技术，使其在蛋白表达和生物制药制备中具有了更广阔的应用前景。
三、蛋白表达1. 重组蛋白表达293ft细胞不仅能够高效地表达内源蛋白，还可以作为重组蛋白表达系统，用于表达外源蛋白。
由于其在短时间内能够高效表达大量蛋白的特性，使得293ft细胞在生物制药制备中备受青睐。
2. 应用前景随着生物制药研究的不断深入，对于蛋白表达系统的要求也越来越高。
而293ft细胞具有易于培养和高产量等特点，使得其在生物制药领域有着广泛的应用前景。
未来，随着细胞工程技术的不断发展，相信293ft细胞在蛋白表达系统中将会有更加广泛的应用。
四、结论通过本文的探讨，我们可以看到293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
悬浮驯化技术和蛋白表达系统的不断完善和发展，也为293ft细胞在生物制药领域的应用打开了更加广阔的前景。
个人而言，我对293ft细胞在蛋白表达系统中的作用和意义有了更加深刻的理解，也对其在生物制药制备中的潜力充满期待。
五、个人观点作为一种重要的蛋白表达系统，293ft细胞在生物制药领域的应用前景不容小觑。
兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用研究摘要：在兽用疫苗的研发生产过程中，动物细胞漂浮培养逐渐得到了研发人员的重视和关注。
当前，在各种兽用疫苗的研发和生产过程中，将动物细胞漂浮培养技术相结合，具有非常显著的科研成果，同时，也能够在一定程度上推动兽用疫苗行业的发展。
基于此，本文阐述了兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用办法，来给技术人员提供一些参考。
关键词：兽用疫苗；动物细胞悬浮培养；优化；应用动物细胞悬浮培养是以生物反应器为载体制备生物制剂的关键技术，目前，已成为国内外生物制剂制备的主要方法。
其最大的优点在于可实现最大限度的产量提升和稳定的生物制剂品质[1]。
然而，由于这一技术在我国还没有普及，其生产仍然是以转瓶细胞培养为主，导致生产成本较高、生产强度比较大，不适应当前生物技术不断发展需求。
因此，如何将动物细胞悬浮培养应用于生物制药工程，是从行业者研究的重点[2]。
1.兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化1.1优化动物细胞系选择研发生产兽用疫苗过程中，技术人员应该从安全性与效应两个角度出发，在提高疫苗生产的经济效益的同时，加大对细胞系的筛选和悬浮驯化的研究力度，使其更可靠、安全。
在筛选过程中，如果是同一种细胞遇到先扩增处理的病毒，会呈现交互作用。
为提高疫苗生产的稳定性和安全性，在投入生产前，要开展适应性实验以明确筛选结果[3]。
1.2保证悬浮驯化的科学性不同阶段的细胞生长态势决定了扩张培养工艺的使用与否。
技术人员通过不同阶段的同一种细胞进行培育，然后经过定期观察细胞的表现差异，能够确保悬浮驯化的科学性。
同时，在驯化过程中，不能忽视稳定因素。
疫苗生产工作时，往往需要通过减少培养基中血清浓度来增强稳定性。
细胞培育过程中，技术人员要避免产生损伤行为。
一旦出现了不可控风险，就会影响培养结果，无法进行修复。
为避免出现类似的情况，要确保细胞活性要≥90％。
1.3科学选择细胞培养基在对不同类型的培养基筛选时，要注意其适应性，要根据具体的条件和需要进行筛选。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达序言作为细胞生物学和生物工程领域的一项重要技术，细胞培养和蛋白表达技术在现代医药和生物科学研究中扮演着至关重要的角色。
而在这一领域，293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达技术则是备受关注的焦点之一。
本文将深入探讨293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达的相关原理、应用以及未来发展方向，帮助读者全面理解和认识这一重要的生物技术。
一、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞的来源和特点293ft细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，来源于人类胚胎肾细胞。
与传统的293细胞相比，293ft细胞经过改良和转染后，在悬浮状态下具有更高的表达效率和更好的生长特性。
这使得293ft细胞在蛋白表达和细胞培养领域得到广泛应用。
2. 悬浮驯化技术的原理与方法悬浮驯化是指将细胞从传统的单层培养方式转变为悬浮状态培养的过程。
对于293ft细胞，悬浮驯化技术的关键在于寻找合适的培养基和培养条件，如活性氧含量、温度和pH值等。
适当的培养器皿和搅拌方式也对悬浮培养效果有重要影响。
3. 应用前景和意义悬浮培养的293ft细胞在蛋白表达、病毒制备等方面具有广阔的应用前景。
其悬浮生长形式使得大规模生产成为可能，从而满足了生物药物和蛋白质的临床需求。
而且，悬浮培养还可以降低生产成本、提高生产效率，为生物制药和生物工程行业带来了巨大的发展机遇。
二、蛋白表达技术1. 蛋白表达的基本原理蛋白表达是指在细胞内或体外，通过特定的基因表达系统将目标蛋白大量合成的过程。
在细胞内表达中，常用的系统有原核细胞表达系统和真核细胞表达系统，而体外表达则利用细胞外的重组蛋白合成系统进行蛋白表达。
2. 293ft细胞在蛋白表达中的优势由于其良好的生长特性和高表达效率，293ft细胞在蛋白表达中具有明显的优势。
研究发现，通过适当的基因组成和培养条件调控，293ft细胞在表达重组蛋白和生产病毒颗粒方面表现出较高的稳定性和效率。
3. 蛋白表达技术在生物医药领域中的应用通过蛋白表达技术，可以大规模生产临床所需的生物药物，如重组蛋白、抗体药物等。
哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展
作者：陆陈晨谭树华
来源：《科学与财富》2018年第13期
摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。
关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养
重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。
现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。
这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。
真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。
1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点
传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]：
1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化；
1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性；
1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。
2 细胞无血清悬浮培养的优势
细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。
3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法
3.1 分子生物学手段改造
贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。
Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的
基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表达。
这种被称为Super CHOr的细胞系接种到微载体或以悬浮方式培养时，通过异丙基-D 硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导，可以在无外源蛋白添加的培养基中以 20-24 小时倍增速度自分泌生长，改造后的悬浮细胞适用于生产重组蛋白。
3.2 降低培养基血清含量
另一种常用的贴壁细胞驯化方法是逐步降低培养基血清含量，细胞适应后最后换成无血清培养基培养[4]。
杨栋，牛红军等人采用逐步降低血清法将表达 rHuEPO 的贴壁 CHO-EPO 工程细胞株驯化成悬浮细胞，摇瓶培养，最终接种至生物反应器放大培养，具体通过每 2 天弃去贴壁培养的 CHO-EPO 方瓶中一半旧培养基，加入等量的无血清基础培养基 B001，培养基中血清浓度依次以5%，2.5%，1.25%，0.625% 降低。
当血清浓度降至 1% 以下，完全以基础培养基 B001 继续培养，即得悬浮 CHO-EPO 细胞[5]。
4 展望
无血清悬浮培养的哺乳动物细胞相比贴壁细胞既可提高细胞的培养密度，黄锭，赵亮，谭文松等人在犬肾细胞MDCK驯化时研究发现MDCK细胞悬浮生长时细胞延滞期缩短，细胞生长速度增快，活细胞密度和细胞活力提高，葡萄糖比消耗速率、乳酸和氨的比生成速率都大幅降低，而乳酸对葡萄糖的转化率有所升高[6]。
同时也消除了血清中动物源性成分对重组蛋白表达的影响，由于杂蛋白较少，也便于后续纯化，更有利于大规模工业化生产。
另外，不同的重组蛋白工程细胞悬浮培养时可能适用于不同类型的无血清培养基，通过对培养基优化筛选可使悬浮细胞在最优的条件下生长和表达重组蛋白。
参考文献
[1] Jayapal KP， Wlaschin KF， Hu WS ， Yap HGS .Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting， Chem Eng Prog[J]，103：2007（40-47）.
[2] Wurm FM .Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells，Nat Biotechnol[J]， 22：2004（1393 -1398）.
[3] S.C.O. Pak， S.M.N. Hunt， M.W. Bridges， M.J. Sleigh & EE Gray，Super-CHO-A cell line capable of autocrine growth under fully defined protein-free conditions， Cytotechnology[J]，1996， 22：（139-146）.
[4] Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono， Sybille Hunt， Charles Bailey， Masood Baig，Merilyn Sleigh & Peter Gray Regulated autocrine growth of CHO cells， Cytotechnology[J]，2000， 34：（39–46）.
[5] YANG Dong， NIU Hong-jun， LU Gang， SHI Jia-lin， SUN Hao-ming， LI Hui* An Optimized Method for Suspension Culture of CHO Cells to Produce Recombinant Human Erythropoietin （EPO）， Progress in Modern Biomedicine[J]，（2012）， 26-5053-04.
[6] Ding Huang， Liang Zhao， and Wensong Tan Adherent and single-cell suspension culture of Madin-Darby canine kidney cells in serum-free medium， Chinese Journal of Biotechnology[J]，2011， 27（4）： 645？652.。
