蛋白表达、分离和纯化

实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。

2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。

考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。

蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

生物制药中的蛋白质表达与纯化技术生物制药是指利用生物技术和生物制备技术生产药品。

蛋白质是重要的生物大分子，在生物制药中，利用蛋白质表达技术制备蛋白质药物已经成为制备生物制药的重要手段之一。

在蛋白质表达和纯化中，重要的问题是选择适合的表达载体和表达宿主细胞，以及优化表达条件，提高表达能力和质量。

此外，表达的蛋白质需要纯化和质量控制等关键步骤，以保证药品的安全有效。

蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指利用基因工程技术将目标蛋白质的编码基因导入到表达宿主细胞内，通过转录和翻译等过程表达出目标蛋白质。

根据表达载体的不同，蛋白质表达技术可分为细胞自主表达和外源表达两类。

细胞自主表达是指目标蛋白质能够在宿主细胞自身的代谢和生理过程中产生和积累。

这种表达方式常见于真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞等。

此外，还有一些原核细胞能够自主表达复杂蛋白质，如高等厌氧菌和嗜热菌等。

外源表达是指将目标蛋白质的编码基因插入到宿主细胞的表达载体中，通过改变细胞代谢和生理状态，促进目标蛋白质的表达。

目前，外源表达技术已经被广泛应用于生物制药领域。

外源表达常用的表达宿主细胞包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等。

在选择表达载体和表达宿主细胞时，需要考虑到许多因素，如表达载体的复制数目、启动子、选择标记、信号序列、表达宿主细胞的生长速度、生理状态、代谢途径等。

蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指将从表达宿主细胞中获得的蛋白质经过一系列的分离、纯化和检测等步骤，去除不必要的成分和杂质，提高目标蛋白质的纯度和活性。

在纯化过程中，需要根据目标蛋白质的生化性质和物理性质选择不同的分离和检测手段，例如亲和层析、逆向层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、凝胶电泳等。

亲和层析是利用亲和基团与目标蛋白质相互作用，实现目标蛋白质的纯化。

通常，亲和基团可与目标蛋白质的某种生化或物理性质相互作用，例如其特异抗原性、活性或生物学功能等。

例如，利用亲和层析纯化抗体、酶或膜受体等蛋白质时，通常采用大量的亲和基团，如包括Ni2 +、酵母己糖、自旋素、脂肪酸酰化酶亲和基团等。

蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。

由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。

本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。

一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。

在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。

（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。

它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。

凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。

（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。

常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。

其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。

二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。

蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。

（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。

常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。

其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。

（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。

常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。

其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。

基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。

先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。

然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。

表达蛋白可经SDS-PAGE检测。

实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。

蛋白质分离和纯化是蛋白质组学研究中必需的技术蛋白质组学是研究生物体内蛋白质种类、结构、功能及其相互作用的学科，是在基因组学研究的基础上，通过高通量技术对蛋白质实现全面分析的一门学科。

而蛋白质分离和纯化则是蛋白质组学研究中最常用的技术手段。

一、蛋白质分离技术蛋白质组学研究中最重要的技术之一就是蛋白质分离技术，这是将复杂的蛋白质混合物分离成单一蛋白质易于研究的过程。

蛋白质分离技术可以根据蛋白质的物理化学性质和结构特征来进行分离。

目前常用的蛋白质分离技术有以下几种：1.凝胶电泳技术凝胶电泳是一种以电泳为基础的分离技术，是实验室中最常用的蛋白质分离技术。

凝胶电泳有许多种类型，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、二维凝胶电泳等，其中SDS-PAGE技术最为常用。

SDS-PAGE技术能将分子量相近的蛋白质分离出来，便于后续的鉴定和纯化。

2.色层分离技术色层分离技术以蛋白质的同种电性、不同待测的酶活性（或它的纯化协因子）进行分离。

常见的色层分离技术有离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、逆向水相色谱和氢氧化铝柱等。

3.分子筛分离技术分子筛分离技术是一种利用分子质量大小差异进行分离的方法，分子筛通常是指分子筛柱，目前广泛采用的是分子排斥色谱柱，一般以戊二醛或者聚山梨醇等为填料，能有效地分离小分子杂质和行动质量与待纯化蛋白质分子量大致相同的杂质。

二、蛋白质纯化技术蛋白质分离并不能直接得到纯净的蛋白质，还需要进行蛋白质纯化。

通常是利用某些特异性技术或单一的物理和化学性质将蛋白质分离出来。

目前常用的蛋白质纯化技术有以下几种：1.亲和层析技术亲和层析是指通过一种化合物(即配体）固定在搭载材料上，然后靶汔蛋白通过目标亲和化合物和固定在搭载材料上的配体之间相互作用，以此达到纯化目的。

2.透析技术透析是将有机化合物从高浓度的介质中移到低浓度的介质中的方法，以此去除杂质并使蛋白质获得更好的空间构象。

3.分子排除色谱技术分子排除色谱以分子量为依据，通过选择性分离小分子与大分子之间的区别来达到去除杂质和获得纯化的蛋白质。

实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。

2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。

考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。

2.3.2.2 蛋白质表达、纯化（1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。

（2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。

（3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。

（4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。

（5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。

（6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。

流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。

使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。

由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。

为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。

（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。

然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。

蛋白质化学研究方法和思路蛋白质化学研究是生物化学领域的一个重要分支，它涉及对蛋白质的结构、功能、相互作用和生物合成的深入研究。

以下是蛋白质化学研究的一些常见方法和思路。

1. 蛋白质分离和纯化：通过各种色谱技术（如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）从混合物中分离目标蛋白质。

使用电泳技术（如SDS-PAGE）对蛋白质进行分子量分析。

2. 蛋白质结构分析：通过X射线晶体学获得蛋白质的三维结构。

利用核磁共振（NMR）光谱学分析蛋白质的二维结构。

通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术观察蛋白质的近原子分辨率结构。

3. 蛋白质功能研究：通过体外酶活实验研究蛋白质的催化功能。

利用细胞生物学实验（如共转染、基因敲除等）研究蛋白质在细胞中的功能。

通过蛋白质相互作用分析（如免疫沉淀、酵母双杂交等）研究蛋白质与其他分子的相互作用。

4. 蛋白质修饰研究：分析蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰形式。

研究修饰对蛋白质结构和功能的影响。

5. 蛋白质表达调控：研究蛋白质的转录后调控机制，如miRNA、转录因子等对蛋白质表达的影响。

分析蛋白质的降解途径和稳定性。

6. 蛋白质组学：利用高通量质谱技术对蛋白质进行鉴定和定量分析。

通过蛋白质组学数据挖掘，发现新的蛋白质功能和研究途径。

7. 计算生物学方法：利用生物信息学工具（如SwissProt、UniProt等）查询和分析蛋白质序列信息。

通过分子对接和分子动力学模拟研究蛋白质与配体的相互作用。

8. 系统生物学：研究蛋白质在生物网络中的角色和功能。

利用系统生物学方法分析蛋白质在复杂生物过程中的作用。

在进行蛋白质化学研究时，通常需要综合运用多种技术和方法，以获得全面的研究结果。

研究过程中，科学家们会根据研究目标和问题，选择合适的研究方法和实验设计，以揭示蛋白质在生命活动中的重要作用。

蛋白质分离与纯化的方法一、蛋白质的粗分离破碎细胞后，所得的蛋白质混合液中除含有目的蛋白质外，还含有其他蛋白质、脂类、多糖及核酸等成分，利用简易、快速的方法除去这些杂质即为蛋白质的粗分离。

(一)盐析法蛋白质在低盐浓度下其溶解度随盐浓度的增加而增加，此现象为盐溶。

但随着盐浓度的继续升高，蛋白质的溶解度又会以不同程度下降，并先后析出，此现象为盐析。

此现象是由于当水中加入少量盐类时，盐离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团产生影响，使其溶解度增大。

但当盐浓度增加到一定程度时，蛋白质所带的电荷被大量中和，水化膜被破坏，分子间相互聚集，而发生沉淀析出。

因此，可根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低的程度不同，而将各种蛋白质彼此分离。

常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。

(二)有机溶剂分段沉淀法通过有机溶剂降低溶液的介电常数，破坏蛋白质的水化膜，导致溶解度的降低而发生沉淀析出，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度存在差异而分离的方法，称为有机溶剂分段沉淀法。

常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。

(三)超速离心法超速离心法是利用物质的沉降系数、质量浮力等方面的差异，用强离心力使其分离的技术。

蛋白质在高达5000kg的重力作用下，在溶液中逐渐沉淀，直至其浮力与离心所产生的力相等，才停止沉降。

不同蛋白质其密度与形态各不相同，故应用离心的方法可将它们分开。

二、蛋白质的细分离待提纯的样品经过破碎及粗分离后，还难以达到纯品的要求时，则需进一步对其进行纯化处理。

(一)透析法利用蛋白质不能通过半透膜这一性质将大分子量蛋白质与小分子量化合物分开。

用具有超小微孔的膜制成透析袋，微孔可允许分子量为10000以下的化合物通过。

将蛋白质混合物装入袋中，再置于水中，则小分子物质如矿物质(无机盐)、单糖等可透过薄膜，不断更换袋外的水，可把袋内小分子物质全部去尽。

如在袋外放吸水剂，同时还可将袋内的水分去尽。

(二)层析法1.凝胶过滤层析凝胶过滤层析又称分子筛层析，是利用分子量的差异使物质彼此分离的方法。

生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。

在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。

蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。

本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。

一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。

蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。

原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。

大肠杆菌是目前最常用的宿主。

一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。

表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。

（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。

GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。

（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。

His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。

二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。

通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。

（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。

离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。