血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

中国组织工程研究与临床康复茹享』2誊笫’5D力铲20081209出版Journalol’ClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchDecember9，2008V01．12，No．50

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达冰冰☆

陈柏松，张胜利，耿红全，潘骏，吴少峰，陈方

ExpressionofvascularendothelialgrowthfactorinendothelialprogenitorcellsfollowingitsexpressionvectorcOnstructiOn

ChenBaisong，ZhangShengli，GengHong—quan，PanJun，WuShao—feng，ChenFangAbstractBACKGROUND：Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)playsanimportantroleinangiogenesisHowever，whethertheconstructionofeukaryoticexpressionvectorcantransfectandexpressinendothelialprogenitorcellsisunclear．OBJECTIVE：Toconstructaeukaryoticexpressionvector，furthermore，toinvestigateitsexpressioninendothelialprogenitorcells．DESIGN．TIMEANDSETTING：ThesampleobservationexperimentwasconductedintheCenterLaboratoryofXinhuaHospital。ShanghaiJiaoTongUniversitySchooIofMedicinefromDecember2007toMarch2008．MATERIALS：ThevectorPDC315一VEGFl65wasselfmadeinthelaboratory．ThevectorplRES2一EGFPwasprovidedbyStankoStojilkovic．aprofessorfromAmeficanNationalInstitutesofHealth．MEHODS：plRES2一EGFP—VEGFexpressionvectorwasconstructedbvDNArecombinanttechniqueandwasintroducedintopigendothelialprogenitorceilsbyliposome—encapsulatedtransfecfion．MAIN0UTCOMEMEASURES：VEGFl65expressioninendothelialprogenitorceUs．1evelofVEGFmRNAandproteinVEGFl65expressionwereidentifiedbvfluorescencemicroscope，RTPCRandELISA，respectively．RESULTS：plRES2一EGFPVEGFexpressionvectorwassuccessfullyconstructed．WhentransfectionrecombinantplasmidplRES2．EGFPVEGF．VEGFexpressioncouldbefoundinendothelialprogenitorcell．VEGFtuRNAandproteinVEGFl65levelswereobviousincreased．CONCLUSl0N：TransfectionVEGFexpressionvectorwithpigendothelialprogenitorcellscaneffectivelyenhancetheexpressionofVEGFgene．canobtainhighleveIofVEGFprotein．ChenBS，ZhangSL，GengHQ，PanJ，WuSF，ChenF．Expressionofvascularendothelialgrowthfactorinendothelialprogenitorcellsfollowingitsexpressionvectorconstruction．ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2008；12(50)：98539856(China)[http：／／www．crter．cnhttp：／／en．zglckf．com】

摘要背景：血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染血管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007一12／200803在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315一VEGFl65自备，质粒plRES2一EGFP由美国国立卫生研究院StankoStojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体plRES2一EGFP—VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGFl65蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体plRES2．EGFP—VEGF。转染重组质粒plRES2．EGFP—VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGFl65蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。关键词：血管内皮生长因子；真核表达载体；内皮祖细胞；基因表达

陈柏松，张胜利，耿红全，潘骏，吴少峰，陈方．血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达[J1-中国组织工程研究与临床康复，2008，12(50)：98539856[http：／／www．crter．orghttp：／／cn．zglckf．com]

>>本文导读<<

梁厦F考嚣：课题得到了国同纾妒玢：论文提供了充分的研究背号，掰筋蔚石层：促进血管生成的因子家自然科学基金(30672108)成功构建了血管内皮生长因子真核表达载很多，实验仅对其中的血管内皮生长和上海交通大学博士点基金体plRES2．EGFP．VEGE并成功转染了内皮因子基因进行观察，未对其他的因子(BXJ0725)的资助，旨在解祖细胞。实验设计合理，方法可靠，结果如碱性成纤维细胞生长因子等进行观决外周血内皮祖细胞基因改可信，具有一定的创新性，为临床可用的察。实验下一步将对其他因子及各种造的的相关实验基础。组织工程化血管构建提供了新的思路，具不同因子的协同作用进行研究。有一定应用意义。

ISSN16738225CN2ij539／RcoDEN：zLKHAHDepartmentofUrology，XinhuaHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySch001ofMedicine．Shanghai20~92，ChinaChenBai—song☆，Studyingfordoctorate，DepartmentofUrologySurgery，XinhuaHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200092．Chinachenbaisong2003@yahoOcorncnCorrespondencetO：ChenFang，DepartmentofUrologySurgery，XinhuaHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySch001ofMedicine，Shanghai200092．Chinachenf007@hotmail

Supportedby：theNationalNaturalScienceFoundationofChina，No30672108‘：FundforDoctorCreativeResearchofShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicineNo．BXJ0725‘Received：2008—05．07Accepted：20080903

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陈柏松．等．虹管内皮生长因子表达载体的构建及在内瘦褪镪咆中的表达

上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海雨200092陈柏松☆，男，1979年生，黑龙江省哈尔滨人，汉族，上海交通大学医学院在读博士，主要从事泌尿系组织工程学研究。chenbaisong2003@yahoo．tom．ca通讯作者：陈方，上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海市200092chenf007@hotmail．com国家自然科学基金资助项目(30672108)。：上海交通大学医学院博士点建设基金项目fBXJ0725)*中图分类号：R392文献标识码：B文章编号：1673．8225(2008)500985304收稿日期：20080507修回日期：20080903(54200805060020／N舀

98540引言

组织工程学研究的兴起和发展，为重建外科提供了新的思路。应用组织工程学方法，以生物相容性良好的聚合物为支架材料，将培养扩增后的种子细胞与支架材料在适宜的条件下联合培养，诱导细胞生长增殖，再造组织工程化组织，最终用于重建修复病损的组织或器官I“。种子细胞增殖、定向分化并形成有生理功能的替代物的关键在于解决种子细胞的营养问题。新生血管是组织细胞进一步生长、增殖、分化的首要条件，如果不能快速实现血管化，较大面积的基质材料将会降解挛缩，影响组织工程构建物的功能B。1。因此促进血管的新生越发引起学者们的重视。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是1989年Ferrara等14’分离出的一种糖蛋白，可特异性地促进血管内皮细胞的生长并诱导血管生成。在目前己知的多种血管生长因子中，VEGF是最强有力的血管生成因子，它通过和特异性受体结合，维持血管正常状态和完整性、提高血管通透性、促进血管内皮增殖和新血管生成【5击】。血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，在血管再生过程中，在多种血管生长因子的作用下，血管内皮组细胞能够转化为内皮细胞，参与构成新生血管，形成特征性的血管网状结构【。”，是组织工程种子细胞研究中的新热点[9】口实验构建了VEGF与增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的共表达载体，并在内皮祖细胞中表达，为今后组织工程血管化研究奠定了实验基础。