2010版中国药典培训回答（第2部分：微生物限度）
广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。
答：没有上限。但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。（本所控制在110%以内）。
2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作培养过程中发现：在玫瑰红钠琼脂培养生长的白色念珠菌的形态太小与营养琼脂上培养的细菌的某些形态大小相同，这样如何判断营养琼脂上生长的菌落是否是白色念珠菌？为何这两种菌落形态相似？
答：菌落形态相似不等于就是同一种菌。在验证时，营养琼脂的验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌为0，则营养琼脂上长的菌应该不是白色念珠菌。要判断是否为白色念珠菌，应进行白色念珠菌的相应鉴定方法后才能确定。任何微生物都不可能只是从菌落就可以进行判断，只能判断为疑似，然后再做一系列相应的鉴定实验后才能进行判断。
3、生孢梭菌的适宜计数用培养基？（很多验证需对生孢梭菌进行计数）
答：最简便的方法是用硫乙醇酸盐流体培养基。该培养基上层为含氧层，适宜需氧菌生长，下层为厌氧层（下层高度最好7cm以上），适宜厌氧菌生长。在培养16~18小时这个时间进行观察，计数，超过20小时,由于繁殖量大，培养基将混浊，点计不清。或者是用哥伦比亚琼脂培养基，浇注后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。
4、微生物限度检查法中所用的培养基要进行适用性检查试验，请问这些培养基还需要做无菌检查试验吗？
答：微生物限度检查，药典上没有特别说明对培养基作无菌性检查，但每次都要做阴性对照实验，阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。
2010年无菌、微生物限度检查培训班
讲 义
《中国药典》2010年版微生物限度（无菌）检查新增修订情况
2010年版《中国药典》为建国以来的第九版药典。
2007年底开始工作，2010元月正式出版，2010年10月1日起实施（中华人民共和国卫生部公告（第
5号））
国家局、国家药典委员会、 120多家参与单位、数百位专家
第一部分：
无菌检查的新增修订
前言部分
1、新增规定：“ 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。”
2、新增规定：“ 日常检验还需要对环境进行监控。”
3、新增规定：“ 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基部分
1、删除：1. 硫乙醇酸盐流体培养基 后括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明
2、删除：2. 改良马丁培养基 后括号（用于培养真菌）的说明
3、删除：3. 选择性培养基 项下加入适量中和剂或表面活性剂后面的 “ 如对氨基苯甲酸（用于
磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）¡
±等说明。
修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）
4、将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查） 修订排列为第 4.
——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查部分
1、修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法：
规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，
制成每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子悬液的操作
方法
2、新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时
内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的
2017.12.28岗位培训课件
微生物知识培训
一、概述
1、概念： 微生物是一种肉眼不能直接看见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能观察到的微小生物的总成。
特点：具有形体微小、结构简单；繁殖迅速、容易变异；种类繁多、分布广泛等特点。
2、作用：绝大多数微生物对人和动物是有益的，广泛应用于农业、食品、医药、酿造、化工等行业，例如与我们日常生活密切相关的如酸奶、酒类、抗生素、疫苗等。
3、危害：微生物中也有一部分能引起人及动、植物发生病害，这些具有致病性的微生物，称为病原微生物。如人类的许多传染病（感冒、痢疾、结核、病毒性肝炎等），均是由病原微生物引起的。
从药品生产的卫生学而言，微生物对药品的原料、生产环境和成品的污染是造成生产失败、成品不合格的重要因素。
4、分类：
（1）细菌 ：细菌是一类细胞细而短、结构简单、细胞壁坚韧，以二分裂方式无性繁殖的原核微生物，分布广泛。
（2）真菌：真菌是一类有细胞壁，无叶绿素，以寄生或腐生方式生存，少数为单细胞，多数为多细胞，能进行无性或有性繁殖的一类真核细胞型微生物。
霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。
酵母菌是单细胞真核微生物，酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长，例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果园土壤中最为常见。
真菌生长的最适的生长温度为22～28℃，最适的pH值为4～6。其繁殖能力强，但生长速度比细菌慢，常需1‐4周才形成菌落。真菌对热的抵抗力不强，一般加热60~70℃1小时即被杀死，对干燥、日光、紫外线和一些化学消毒剂有抵抗力，但对2.5％碘酒、10％甲醛则较敏感。
（3）病毒：病毒体积微小，大多数病毒只有采用电子显微镜将其放大数千、数万倍才能看见。
二、消毒与灭菌
1、消毒：杀死物体上病原微生物的方法,并不一定能杀死含细菌的芽胞。消毒所用的试剂称为消毒剂。
《中国药典》2005年版微生物限度检查的方法学验证
微生物限度检查的范围
根据药品使用要求,把药品化为两大类:
(1) 规定灭菌药品:
(2) 非规定灭菌药品:
在非灭菌的各种制剂中,对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定
(1)染菌量检查:包括细菌数,霉菌数及酵母菌数测定,以检查这几类微生物对药品的污染程度.
(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌,大肠菌群，沙门菌,金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌,生孢羧菌及
白色念珠菌.
药品微生物限度检验中的困难,最根本的原因在于检验对象本身的特殊性.
(1) 不确定性:
(2) 分布的不均匀性:
(3)活体特征:药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性.
验证的目的
确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查,即确认供试品在该检验量、该检验条件下无
抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。 保证检验结果的准确、可靠及检验方法的
完整性。
验证的类型
（1）建立药品的微生物限度检查法时。
（2）修订的检验方法。
（3）供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 。
（4）定期的验证。
（5）同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证，以确认
所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。验证时，按供试液的制备和细菌、霉
菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
微生物限度检查样品
（1）首先应是合格的样品。
（2）本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。
供试液的制备
制剂形式多样，决定前处理各异
1.液体供试品
取供试品溶液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀作为1:10的供试液.油剂
可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液.
2.固体、半固体或粘稠性供试品
