第三章质粒的分子生物学与质粒载体(精)

质粒及质粒载体复习题及答案一、填空题1、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体。

2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同。

SC DNA的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。

3.就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分：复制子（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA插入）。

另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。

4.如果两个质粒不能稳定地共存于一个寄主细胞中，则属于同一个不亲和群，这是因为它们的复制机制相同所致。

5.质粒拷贝数是指细胞中质粒的份数同染色体的比值，即质粒/染色体。

6.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫质粒消除（或治愈）。

7.PBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于pMBl ,它的四环素抗性基因来自于pSClOl ,它的氨节青霉素抗性基因来自于PSE2124 （R质粒）。

8.YAC的最大容载能力是1000~2000kb , BAC载体的最大容载能力是300kb 。

9.把那些没有可检测表型的质粒称为隐蔽性质粒。

10.pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。

pUC系列的载体是通过PBR322和M13两种质粒改造而来。

它的复制子来自pMBl , Amp抗性基因则是来自转座子。

11・Ti质粒是自然界存在的植物基因工程的天然载体。

12.既能在夙coll又能在S・cerevisiae中自我复制的载体DNA称为穿梭载体。

二、选项题（单选或多选）1.下面关于松弛型质粒（relaxed plasmid）性质的描述中，（C ）是不正确的。

的制约, 而有较多的拷贝数A.质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制B.可以在氯霉素作用下进行扩增C.通常具有较少的拷贝数D.同严紧型质粒整合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子2.基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（B ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体。

质粒载体简介质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。

自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。

大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。

质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。

质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。

质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。

一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。

质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。

人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。

适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。

低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。

它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。

失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。

如pBEU1、pBEU2。

插入失活型克隆载体。

载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。

如pDF41、pDF42。

正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。

只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

质粒载体的筛选特征选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。

所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。

分子生物学课程教学大纲课程简介一、课程简介分子生物学主要研究核酸蛋白质等所有生物大分子的结构、功能及基因结构、基因表达，以及生物大分子互相作用以及生理功能，以此了解不同生命形式特殊规律的化学和物理的基础。

分子生物化学是在分子水平上研究生命奥秘的学科，代表当前生命科学的主流和发展的趋势。

医学分子生物学是分子生物学的重要分支，本课程包括三方面的内容：一是介绍分子生物学基本原理；二是阐述某些疾病发生和发展的分子机制；三是介绍分子生物学技术在临床上的应用。

本大纲适用于夜大专升本等专业学生。

二、总体要求通过本课程学习，要求学生做到：1. 掌握、熟悉分子生物学的基本原理以及与相关临床知识的联系。

2. 学会应用基本分子生物学技术进行生物大分子的检测，并能应用于临床。

3. 树立良好的学习态度，培养创新能力与实践能力，注重知识、能力、素质的协调发展。

三、时数分配绪论学习目的和要求通过本章学习，掌握医学分子生物学的定义、内容。

课程内容一、介绍医学分子生物学的定义。

二、介绍医学分子生物学的发展历史。

三、医学分子生物学的现状与未来。

考核知识点一、医学分子生物学的定义。

二、医学分子生物学的内容。

三、医学分子生物学发展过程中的一些重要历史事件。

四、医学分子生物学的现状与未来。

考核要求一、掌握医学分子生物学的定义。

二、熟悉医学分子生物学主要解决的问题。

三、了解1. 医学分子生物学发展过程中的一些重要历史事件。

2. 医学分子生物学的未来发展方向。

第一章基因学习目的和要求通过本章学习，掌握基因的基本概念、基因的结构特点及基因的遗传功能，了解基因突变的机制及其与疾病的关系。

课程内容一、基因的基本概念及基因的结构特点1．核酸是遗传信息的载体大部分生物中构成基因的核酸物质是DNA, 少数生物（如RNA病毒）中是RNA。

2．基因的基本概念基因的现代分子生物学概念。

3．基因的结构特点基因的基本结构包括结构基因和转录调控序列。

原核生物的结构基因是连续的，而真核生物的结构基因是不连续的，由内含子和外显子组成。

质粒载体的知识点1. 什么是质粒载体？质粒载体是一种常见的DNA分子，在分子生物学研究中广泛应用。

它是一种环状的DNA分子，具有自主复制和传递的能力，能够携带外源DNA序列并在细胞内进行复制和表达。

2. 质粒载体的特点质粒载体具有以下几个特点：•自主复制能力：质粒载体可以独立于宿主细胞的染色体进行复制，从而实现外源DNA的复制。

•传递能力：质粒载体可以在细菌、酵母等微生物细胞中传递，从而实现外源DNA的表达。

•多样性：质粒载体种类繁多，可以根据实验需要选择不同的质粒载体来进行研究。

•多拷贝数：质粒载体通常具有多个拷贝数，使得外源DNA在细胞中得到高效复制和表达。

3. 质粒载体的结构质粒载体通常由以下几个部分组成：•起始子：负责启动质粒载体的复制过程。

•多个限制酶切位点：用于将外源DNA序列插入到质粒载体中。

•选择标记：帮助筛选携带质粒载体的细胞，例如抗生素抗性基因。

•表达元件：包括启动子、终止子和转录调控序列，用于控制外源DNA的表达水平。

4. 质粒载体的应用质粒载体在分子生物学研究中有广泛的应用，包括：•基因克隆：质粒载体可以用于将外源DNA序列引入到细胞中，从而克隆目标基因。

•基因表达：质粒载体可以用于外源基因的表达，从而研究其功能和调控机制。

•基因敲除：质粒载体可以用于引入RNA干扰或基因敲除工具，从而研究基因的功能。

•疫苗研究：质粒载体可以用于构建疫苗候选物，进行疫苗研究和疫苗开发。

5. 质粒载体构建的步骤质粒载体的构建通常包括以下步骤：1.选择质粒载体：根据实验需求选择合适的质粒载体，包括质粒大小、拷贝数和选择标记等因素。

2.线性化质粒载体：使用适当的限制酶切酶将质粒载体线性化，以便后续插入外源DNA序列。

3.插入外源DNA：将目标DNA序列与线性化质粒载体连接，并使用DNA连接酶进行连接反应。

4.转化宿主细胞：将质粒载体导入宿主细胞中，可以使用化学方法或电穿孔等技术实现质粒转化。

5.筛选正品系：根据质粒载体携带的选择标记进行筛选，例如使用抗生素选择培养基筛选带有抗生素抗性的细胞。

基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。

在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。

基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。

2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。

3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。

质粒的分⼦⽣物学与质粒载体第三章质粒的分⼦⽣物学与质粒载体⼀、填空题1．基因⼯程中有3种主要类型的载体：——-------、------------⼀、-----------.2.由于不同构型的DNA插⼊EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染⾊的⽅法可将不同构型的DNA分别开来。

3.质粒的复制像染⾊体的复制⼀样，是从特定的起始点区开始的。

然⽽，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。

在杂种质粒中，每个复制⼦的起点都可以有效地加以使⽤。

但是在正常条件下只有⼀个起点可能居⽀配地位。

并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。

4.就克隆⼀个基因(DNA⽚段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。

另外，⼀个理想的质粒载体必须具有低分⼦量。

5.如果两个质粒不能稳定地共存于同⼀个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。

6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。

7.复制⼦由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。

8.酵母的2µm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。

9.⼀个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养⼀段时间后，⼀部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。

10.pBR322是⼀种改造型的质粒，它的复制⼦来源于----——，它的四环素抗性基因来⾃于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来⾃于—---------—。

分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。

三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。

超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

质粒载体种类质粒载体是分子生物学实验中常用的工具，用于在细胞中携带外源DNA序列，并实现其在细胞内的复制和表达。

根据其结构和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型。

本文将介绍常见的几种质粒载体及其特点。

一、表达质粒载体表达质粒载体是常用的质粒载体类型之一，用于外源基因的表达。

其中，pUC18是常用的表达质粒载体，其大小为2686bp，含有多个重要的功能元件。

例如，pUC18包含了抗生素耐受基因，如AmpR基因，使得细菌能够在含有抗生素的培养基上生长。

此外，pUC18还包含了启动子、终止子和复制起始位点等重要序列，能够实现外源基因在细菌中的高效表达。

二、克隆质粒载体克隆质粒载体是用于基因克隆的质粒载体类型。

pBluescript II KS+是常用的克隆质粒载体，其大小为2960bp。

pBluescript II KS+含有多个克隆位点，如多克隆位点（MCS），能够方便地进行DNA片段的插入和克隆。

此外，pBluescript II KS+还包含了T7和T3启动子，使得插入的DNA片段能够通过转录和转录后修饰的方式进行进一步研究。

三、RNA干扰质粒载体RNA干扰质粒载体是用于RNA干扰实验的质粒载体类型。

pSUPER是常用的RNA干扰质粒载体，其大小为3144bp。

pSUPER含有特定的siRNA序列，能够通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达。

此外，pSUPER还包含了启动子和选择性标记基因，使得转染细胞后能够通过选择性培养基筛选出抑制特定基因表达的细胞株。

四、双杂交质粒载体双杂交质粒载体是用于蛋白质相互作用研究的质粒载体类型。

pGBKT7和pGADT7是常用的双杂交质粒载体，分别用于检测靶蛋白的DNA结合活性和激活活性。

pGBKT7和pGADT7含有启动子、选择性标记基因和多克隆位点等重要元件，能够实现蛋白质相互作用的检测和分析。

五、表面显示质粒载体表面显示质粒载体是用于细胞表面展示外源蛋白的质粒载体类型。

分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。

细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。

质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。

F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。

质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。

根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。

1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。

它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。

启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。

常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。

这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。

2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。

它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。

常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。

这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。

3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。

它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。

外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。

常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。

这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。

4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。

它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。

外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。

常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。

这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。

5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。

质粒载体引言质粒载体在基因工程和分子生物学研究中被广泛应用。

它们是由人工合成的DNA片段构建而成，可用于在细胞中传递、复制和表达外源基因。

质粒载体的研究为基因治疗、基因工程和生物技术的发展提供了重要的支撑。

本文将介绍质粒载体的定义、特点、常见类型以及其在科研和应用领域中的应用。

一、质粒载体的定义和特点质粒载体是一种可自主复制的环状DNA分子，它具有许多特点使其成为优秀的基因工程工具。

首先，质粒载体具有较高的稳定性，可以在宿主细胞中长时间保存。

其次，质粒载体可以携带较大的外源DNA片段，为基因操纵提供了更大的灵活性。

此外，质粒载体还具有选择标记，方便筛选和鉴定已转化的细胞。

二、常见类型的质粒载体目前，有许多种类的质粒载体可供科研人员选择使用。

其中包括表达质粒、克隆质粒、慢病毒质粒等。

表达质粒是最常见的一种质粒载体，用于在宿主细胞中表达外源基因。

克隆质粒则是用于合成、扩增和克隆基因或DNA片段。

慢病毒质粒是一种特殊类型的质粒载体，可用于稳定地传递外源基因到宿主细胞中。

三、质粒载体在科研中的应用质粒载体在科学研究中起着重要的作用。

首先，通过将外源基因插入质粒载体中，科研人员可以进行基因的合成、修饰和复制。

其次，质粒载体也被广泛用于表达外源基因以进行蛋白质的表达和功能研究。

此外，质粒载体还可以用于构建基因库、进行基因的定向突变以及筛选重组细胞等。

四、质粒载体在应用领域中的应用除了在科研中的应用，质粒载体还在许多应用领域中发挥着重要的作用。

在农业领域，质粒载体被用于转基因作物的研发，以提高作物的产量和抗病能力。

在医学领域，质粒载体则广泛应用于基因治疗和基因疫苗的研究，用于治疗多种疾病和预防感染性疾病的发生。

此外，质粒载体还可以用于工业发酵和环境修复等领域。

结论质粒载体作为一种强大的基因工程工具，在科研和应用领域中发挥着重要的作用。

通过插入外源基因到质粒载体中，我们可以实现基因的合成、表达和修饰。

质粒载体在农业、医学、工业和环境等领域都有广泛的应用，为许多领域的研究和发展提供了重要的支持。