染色步骤
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HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。
㈠染色程序1．石蜡切片HE染色（常规HE染色）（1）二甲苯Ⅰ 5～10min（2）二甲苯Ⅱ 5～10min（3）无水乙醇Ⅰ 1～3min（4）无水乙醇Ⅱ 1～3min（5）95%乙醇Ⅰ 1～3min（6）95%乙醇Ⅱ 1～3min（7）80%乙醇 1min（8）蒸馏水 1min（9）苏木素液染色 5～10min（10）流水洗去苏木素液 1min（11）1%盐酸-乙醇 1～3s（12）稍水洗 1～2s（13）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（14）流水冲洗 1～2min（15）蒸馏水洗 1～2min（16）0.5%伊红液染色 1～3min（17）蒸馏水稍洗 1～2s（18）80%乙醇 1～2s（19）95%乙醇Ⅰ 2～3min（20）95%乙醇Ⅱ 2～3min（21）无水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min（22）无水乙醇Ⅱ 3～5min（23）石炭酸-二甲苯 3～5min（24）二甲苯Ⅰ 3～5min（25）二甲苯Ⅱ 3～5min（26）二甲苯Ⅲ 3～5min（27）中性树胶封固注：①（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
②（23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。
2．冰冻切片HE染色（1）冰冻切片固定 10～30s（2）稍水洗 1～2s（3）苏木素液染色（60℃） 30～60s（4）流水洗去苏木素液 5～10s（5）1%盐酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s（6）稍水洗 1～2min（7）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（8）流水冲洗 15～30s（9）0.5%伊红液染色 1～2min（10）蒸馏水稍洗 1～2min（11）80%乙醇 1～2min（12）95%乙醇 1～2min（13）无水乙醇Ⅰ 1～2min（14）无水乙醇Ⅱ 1～2min（15）石炭酸-二甲苯 2～3min（16）二甲苯Ⅰ 2～3min（17）二甲苯Ⅱ 2～3min（18）中性树胶封固注：①（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
②（15）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。
㈡染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。
钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。
㈢染色注意事项1．切片染色前，应彻底脱蜡。
2．用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐：（1）石蜡切片脱蜡至水洗（2）Lugol液 20min（3）流水冲洗 5min（4）95%乙醇 10min（5）水洗 1min（6）5%次亚硫酸钠水溶液 5min（7）流水冲洗 5min（8）显微镜观察除汞满意后，转入HE染色3．脱除福尔马林色素（必要时）：（1）石蜡切片脱蜡至水洗（2）1%NaOH(1ml)与80%乙醇（99ml）混合液 10min（3）流水冲洗 5min（4）转入HE染色4．严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。
HE染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。
5．载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。
封盖处内无气泡，外无溢胶。
封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。
不应将组织切片烤干或风干后再行封片。
6．必须在载玻片的一端牢贴标签。
标签上应印有病理科所在的医院名称。
标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。
7．制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。
8．石蜡切片-HE染色的优良率（甲、乙级切片所占的比率）应≥85%。
石蜡切片-HE染色质量的基本标准列于附表。
9．制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含进行脱钙、脱脂等需要特殊处理的标本）。
10．制片过程出现意外情况时，技术室人员应及时向病理医师和科主任报告，设法予以补救。
附表常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准优质标准满分质量缺陷减分⒈组织切面完整，①组织稍不完整：减1～3分②不完整：减4～10分内镜咬检、穿刺标本切面数 10 ③未达到规定面数：减5分⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均匀 10 ①切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减6～10分②厚薄不均匀：减3～5分⒊切片无刀痕、裂隙、颤痕 10 ①有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分②有刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分⒋切片平坦，无皱褶、折叠 10 ①有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分②有皱褶折或折叠，影响诊断：各减5分⒌切片无污染 10 有污染：减10分⒍无气泡（切片与载玻片间/ 10 ①有气泡：减3分盖片与切片、载玻片间），②胶液外溢：减3分盖片周围无胶液外溢⒎透明度好 10 ①透明度差：减1～3分②组织结构模糊：减5～7分⒏细胞核与细胞浆染色对比清晰 10 ①细胞核着色灰淡或过蓝：减5分②红(细胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5分⒐切片无松散，裱贴位置适当 10 ①切片松散：减5分②切片裱贴位置不当：减5分⒑切片整洁，①切片不整洁：减3分标签端正粘牢，编号清晰 10 ②标签粘贴不牢：减3分③编号不清晰：减4分合计 100切片质量分级标准：①甲级片：≥90分（优）②乙级片：75～89分（良）③丙级片：60～74分（基本合格）④丁级片：≤59分（不合格）㈣HE染色试剂的配制1．苏木素染液（1）Harri苏木素染液苏木素 1g无水乙醇 10ml硫酸铝钾 20g蒸馏水 200ml氧化汞 0.5g冰醋酸 8ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾；然后将该两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。
使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。
（2）Gill改良苏木素液苏木素 2g无水乙醇 250ml硫酸铝钾 17g蒸馏水 750ml碘酸钠 0.2g冰醋酸 20ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水溶解硫酸铝钾；然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。
使用前过滤。
（3）Mayer改良苏木素液A液：苏木素 2g无水乙醇 40mlB液：硫酸铝钾 100g蒸馏水 600ml将苏木素溶于无水乙醇中（A液）；稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B液）。
将A液与B液混合后煮沸2min，再用蒸馏水补足至600 ml，加入400mg碘化钠充分混匀。
染液呈紫红色。
2. 盐酸－乙醇分化液浓盐酸 1 ml70%乙醇 99 ml3．伊红液（1）0.25～0.5%伊红Y水溶液伊红Y 0.25～0.5 g蒸馏水 100 ml冰醋酸 1滴（2）0.5%伊红Y-氯化钙水溶液伊红Y 0.5 g蒸馏水 100 ml无水氯化钙 0.5 g（3）0.25～0.5%伊红Y-乙醇溶液。
伊红Y 0.25~0.5 g80%乙醇 100 ml4．石炭酸-二甲苯混合液石炭酸 1份二甲苯 3份石蜡组织切片的HE染色1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。
2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3．苏木素染色5min，自来水冲洗。
4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。
5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。
6．置伊红液2min。
7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。
免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
