山东大学实验报告2018年4月9日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：1-1科目：细胞生物学实验题目：动物细胞融合实验学号：201600140055 实验序号：4一、目的要求1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
二、实验原理1、细胞融合的概念细胞融合(cell fusion)，细胞遗传学名词，是在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个双核或多核的杂种细胞的过程，也被称为细胞杂交（cell hybridization）。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱导融合。
2、细胞融合的方法及发展简史①诱导细胞融合的方法：a.生物法（病毒诱导融合）：某些病毒因为其被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，同时也可以介导细胞与细胞的融合，所以这些病毒经紫外线灭活后可作为细胞融合的生物诱导剂使用，例如仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等。
b.化学法（化学诱导融合）：很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是广泛使用的化学融合剂。
c.物理法（电激诱导融合）：包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
②细胞融合的发展简史Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。
Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
Cienkawski(1876）、Buck(1877）、Geddes(1880）在无脊椎动中发现了细胞合并现象。
1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
1978年Ulrich Zimmermann（德国）发明并制造出世界上第一台“电融合仪”，首次报道了电融合技术。
其融合率又提高数百倍。
有效融合率达50-80%。
1984年日本的柏屋高弘（Takahrio kasuya）等研制成功世界上第一台“激光融合仪”，使细胞融合更快捷。
3、聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合◆聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
◆PEG是一种亲脂剂，能扰乱和破坏脂双层的分子结构，使两细胞接触点处膜质的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核或多核融合细胞。
◆PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。
4、细胞融合的应用◆细胞工程基础：动物细胞——单克隆抗体制备；植物细胞——繁育新品种。
◆研究细胞的遗传和发育：基因表达和激活观察。
◆核质关系研究核起主导作用但收到质的影响。
三、实验用品1. 材料：鸡血红细胞，兔血红细胞。
2. 试剂：50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
3. 器材：普通光学显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸等。
四、实验步骤1、取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6mL Alsever液，混匀后制悬液（4℃保存），即为鸡血红细胞母液（此步骤已由老师完成）。
2、取1ml母液+4ml的0.85%的NaCl溶液，在1200r/min下离心5min，去上清液，再加入5 mL 0.85%的氯化钠溶液。
3、1200 r/min 离心5分钟，去上清液。
4、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。
5、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mL GKN液，使每毫升含血球15,000,000个（即1500万个），混匀后即得到血红细胞稀释液。
6、分别按照如下的比例吸取鸡红细胞稀释液、50% PEG液、及兔血，混匀常温下静置2-3分钟后显微镜下观察，记录下观察结果：a)1mL鸡血红细胞稀释液+0.5mL 50% PEG；b)0.5mL鸡血红细胞稀释液+0.5mL 50% PEG；c)0.5mL鸡血红细胞稀释液+1mL 50% PEG；d)0.25mL鸡血红细胞稀释液+0.25mL兔血+0.5mL 50% PEG。
五、实验结果1、在三个不同浓度的鸡血红细胞与50%PEG的混合溶液中，都可以看到鸡血红细胞相互之间出现一些黏着甚至融合的现象，其中PEG浓度最高的c液中细胞融合的程度更深，现象更明显，以下附上试验照片，拍摄时间为4月9日下午。
图1 鸡血红细胞融合整体结果（10×40）图2 两鸡红细胞初步开始融合（10×40）图3 两鸡红细胞之间膜逐渐融合（10×40）图4 两鸡红细胞基本融合为一体（10×40）图5 两鸡红细胞融合完毕（10×40，示双核）图6 三个鸡红细胞基本融合为一体（10×40）图7 四个鸡红细胞发生细胞融合（10×40）图8 多个鸡红细胞发生细胞融合（10×40）图9 大量鸡红细胞融合成不规则状团块（10×40）2、在鸡红细胞和兔红细胞及50%PEG的混合溶液中既可以观察到鸡红细胞之间的融合现象、又可以观察到兔红细胞之间的融合现象，还可以观察到鸡红细胞与兔红细胞发生细胞融合的现象，以下为相关试验照片，拍摄时间为4月9日下午。
图10 鸡红细胞与兔红细胞混合液细胞融合现象整体结果（10×40）图11 两兔红细胞发生细胞融合（10×40）图12 两兔红细胞融合成哑铃型（10×40）图13 两兔红细胞基本融合完毕（10×40）图14 多个兔红细胞发生细胞融合（10×40）图15 鸡、兔红细胞相互黏着（10×40）图16 鸡、兔红细胞开始发生细胞融合（10×40）图17 鸡、兔红细胞进一步融合（10×40）图18 鸡、兔红细胞基本融合为一体（10×40）图19 鸡、兔红细胞分别发生细胞融合的横向比较（10×40）六、注意事项1、取鸡血时应注意加入Alsever液，给鸡红细胞提供养分，使其可以在实验前持续保持生理活性。
2、离心前要注意加入等渗的氯化钠溶液，而不能使用蒸馏水。
3、配置10%细胞悬液时应根据离心管底部红细胞的量来决定加入的GKN液的量，以保证细胞悬液的浓度在10%左右。
4、当PEG的加量较大时（比如b液和c液），应在加入50%PEG液后稍等40s，让密度较大的PEG液沉在试管底部，之后在震荡摇匀，以防密度较大的PEG液在溶液上方直接离心，对红细胞产生较大压力，导致细胞破裂或融合成团块，影响实验结果。
5、加完PEG液后，应稍等2-3min等待细胞充分融合后再观察。
七、思考与讨论1、实验过程中，发现PEG浓度高的c液中细胞融合程度比a液和b液稍高，但不明显，重新取鸡红细胞悬液和兔红细胞悬液各0.25mL，加入3mLPEG溶液，混匀，等待两分钟后显微镜下观察，发现红细胞融合现象极为明显，大量红细胞融合结成巨大的团块，以至于甚至形成类似于细胞凝集反应中肉眼可见的红色粉状颗粒，推测加大PEG的加量很可能能够使细胞融合更剧烈。
2、实验过程中，先取加入PEG混匀后2min的细胞悬液观察，之后再从试管中取反应10min的细胞悬液观察，理论上发现反应10min的细胞悬液中细胞融合现象会更明显，但实际上差别并不明显，尤其在PEG加量少的a液中，推测可能是由于反应的时间还不够长，或者加入PEG后的混匀阶段就已经使细胞间进行了比较充分的接触和反应，致使之后静止期间细胞融合反应发生的较为缓慢。
3、发现用振荡器进行更长时间震荡后的细胞悬液内细胞融合现象会更明显，推测是在高速的震荡中红细胞之间相互碰撞，细胞融合发生的概率增大，建议可以增加一组实验内容，用加入等量红细胞悬液和50%PEG液的三组悬液，分别用振荡器震荡5s,20s,60s，之后显微镜下观察，比较各悬液之间细胞融合的程度有无明显差别。
4、实验过程中发现加入等量鸡血红细胞悬液和兔红细胞悬液的那组装片中，显微镜下观察到兔红细胞的数量比鸡红细胞多，推测可能是鸡红细胞悬液的稀释倍数比兔红细胞悬液的稀释倍数大，或者兔血中红细胞含量原本就比鸡血高，或者稀释是按照离心后红细胞体积进行的稀释，而兔红细胞个体小，等体积情况下数目更多。
5、观察到兔红细胞发生细胞融合的比例比鸡红细胞高，且兔红细胞在混合细胞悬液中呈球状而非圆盘状，推测兔红细胞在0.85%的氯化钠溶液中发生低渗吸水现象，导致细胞膨大呈球状，细胞形状的改变使兔红细胞间更容易发生细胞融合，而鸡红细胞在0.85%的氯化钠等渗溶液依然呈圆盘状，细胞性状不利于细胞融合的发生，建议尝试使用0.8%的氯化钠溶液作为鸡红细胞的稀释液，使鸡红细胞发生吸水膨胀，看能否提高鸡红细胞发生细胞融合的概率。
