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分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
6-2 基因工程及其应用教学设计教材分析1. 教学内容分析高中生物必修2遗传与进化模块第6章从杂交育种到基因工程是整本书的一个重点内容。
而该章的第2节基因工程及其应用中，基因工程的原理及基本操作程序又是该章节的重中之重，在本章中起到承上启下的作用，上承DNA重组技术的基本工具，下接基因工程的应用，难点多，内容杂，较抽象，学生不易理解，学好这部分内容对学生从遗传与变异角度理解生命活动至关重要。
2. 课程标准要求搜集生物变异在育种上应用的事例。
关注转基因生物和转基因食品的安全性。
教学目标（三维教学目标）【知识目标】1、简述基因工程的基本原理。
2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。
3、关注转基因生物和转基因食品的安全性。
【能力目标】进行转基因生物和转基因食品安全性的资料搜集和分析。
【情感目标】1、关注转基因生物和转基因食品的安全性。
2、讨论从杂交育种到基因工程这一科技发展历程中，科学、技术和社会的相互作用。
教学重点：1、基因工程的基本原理2、基因工程的操作过程教学难点：1、基因工程的基本原理2、基因工程的操作过程教学策略或方法：从对杂交育种及诱变育种的特点总结入手，结合“问题探讨”，引入基因工程的概念，将重点放在引导学生了解基因工程的基本原理和大致过程上。
在教学过程中，结合学生熟悉的具体事例来讲述，并安排学生制作模型来模拟基因工程的操作过程，使学生切身体会基因工程“剪、拼、接、转”的主要过程。
本节课的侧重点是基因工程的原理，因此在教学深度上定位于学生了解基因工程的过程和方法，不必引入过多的专业术语和详细的操作技术。
通过本节课的学习，学生应了解基因工程所用到的“工具”和基因工程的大致过程。
教学方法为讲述法、讨论法教学用具：黑板、粉笔、多媒体课件教学板书：基因工程一、概念：二、步骤：1、提取目的基因；2、目的基因与运载体的结合；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测和表达。
三、工具：基因剪刀——限制性内切酶基因针线——DNA连接酶基因的运载体——质粒、噬菌体、动植物病毒等。
最新全基因组测序逐步克隆方法的流程优化与应用全基因组测序是基因组学研究的重要工具之一，可以获得一个生物体的完整基因组序列。
为了进一步推动全基因组测序技术的发展和优化，不断提高测序效率和准确性，最新的全基因组测序逐步克隆方法的流程优化与应用也成为了当前的研究热点之一。
最新的全基因组测序逐步克隆方法的流程优化与应用主要包括以下几个关键步骤：1. DNA 提取：首先，需要从样本中提取出待测序的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、磁珠法和CTAB法等。
流程优化主要集中在提取过程中的DNA质量和纯度的提高，以保证后续测序的可靠性。
2. DNA文库构建：DNA文库构建是全基因组测序的核心步骤之一。
将提取的DNA片段通过酶切或超声打断等方法得到一定长度的DNA片段，然后在片段的两端加上适配体序列。
文库构建的关键是控制文库片段的长度分布，以及适配体的选择和修饰。
文库质量的优化可以通过优化DNA片段的大小分布、适配体的纯度和修饰等方式来实现。
3. PCR扩增：为了将文库中的DNA片段扩增到足够的数量以供测序使用，需要进行PCR扩增。
PCR扩增是通过DNA聚合酶在合适的温度和条件下，使DNA模版的两条链依靠引物进行互补扩增的过程。
PCR扩增的优化涉及到引物的设计、PCR条件的优化以及降低扩增的偏序等方面。
4. 文库纯化和质检：PCR扩增后需要对文库进行纯化和质检。
纯化的目的是去除掉引物、杂质和未扩增的产物等，以减少它们对后续测序的干扰。
质检则是评估文库的质量和浓度，通常通过琼脂糖凝胶电泳、定量PCR或荧光测序仪等方法来实现。
5. 建库和测序平台选择：根据实际需求和预算情况，选择适合的建库和测序平台。
目前，常见的建库平台包括Illumina、PacBio和OXford Nanopore等，而测序平台则包括高通量测序仪和第三代测序仪等。
合理的选择可以提高全基因组测序的效率和准确性。
6. 数据分析和结果解读：全基因组测序的流程优化也需要结合数据分析和结果解读才能真正发挥其潜力。
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
基于全基因组测序的逐步克隆法的重要步骤全基因组测序是一种非常重要的分子生物学技术，在生物学研究以及医学诊断和治疗中有着广泛应用。
而基于全基因组测序的逐步克隆法则是一种常用的策略，用于获取特定基因或片段的完整序列。
下面将详细介绍基于全基因组测序的逐步克隆法的重要步骤。
第一步：建立文库基于全基因组测序的逐步克隆法的第一步是建立基因组文库。
该文库由目标生物的DNA组成，其中包含了整个基因组的所有序列。
为了建立文库，首先需要提取目标生物的基因组DNA。
然后，将DNA片段进行随机酶切或机械切割，生成一系列不同长度的DNA片段。
接下来，将这些DNA片段连接到适当的载体上，并将其插入能够容纳大片段DNA的宿主细胞中。
第二步：测序文库建立完基因组文库后，接下来需要对文库进行测序。
目前，测序方法主要有两种：Sanger测序和高通量测序。
Sanger测序是一种传统的测序方法，通过测定DNA链延伸过程中释放的荧光信号来确定碱基顺序。
高通量测序则是一种快速且高效的测序技术，通过将DNA分成数以百万计的小片段，同时进行测序，并通过计算机软件将这些小片段的顺序重新组合成完整的序列。
第三步：选择目标基因或片段测序完基因组文库后，接下来需要选择目标基因或片段。
根据研究目的和克隆策略，可以选择特定基因、序列长度或其他目标。
基于全基因组测序的逐步克隆法的一大优势就是可以同时获取整个基因组的信息，因此可以根据需要选择感兴趣的基因或片段进行进一步研究。
第四步：设计引物和扩增目标片段在选择目标基因或片段后，接下来需要设计引物用于扩增目标片段。
引物应该与目标序列的两端相互衔接，同时还需要保证引物的特异性，以避免扩增到非目标片段。
引物设计可以借助计算机软件进行，通常通过在目标序列两端添加适当的引物序列，然后使用聚合酶链式反应（PCR）进行扩增。
第五步：克隆目标基因或片段在扩增目标片段后，接下来需要将其进行克隆。
常用的克隆方法包括限制性内切酶克隆、TA克隆、基于CRISPR等。
高通量基因测序技术及数据分析随着科学技术的不断进步，基因测序技术也取得了巨大的突破。
高通量基因测序技术（high-throughput sequencing technology）是一种快速、精确、高效的测序技术，它可以大大缩短测序时间，降低成本，从而在基因研究领域取得重大突破。
高通量基因测序技术的原理是将DNA或RNA样品分为微小的片段，并在高通量测序仪中进行并行测序。
这种技术通过同时测序多个DNA片段，极大地提高了测序效率。
高通量测序技术可以应用于各种领域，包括基因组学、转录组学、表观遗传学和蛋白质组学等。
高通量基因测序技术主要有以下几种：Illumina测序技术、Ion Torrent测序技术、PacBio测序技术和Oxford Nanopore测序技术。
其中，Illumina测序技术是最常用的高通量测序技术之一。
它基于桥式PCR和碱基按键扩增（SBG）技术，可以快速、高效地获得大量的测序数据。
高通量基因测序技术的应用广泛。
在基因组学研究中，高通量测序技术可以用于对物种的全基因组进行测序，帮助研究人员了解物种的遗传变异、进化历程和功能等。
在转录组学研究中，高通量测序技术可以实现对整个基因组的转录本进行测序，从而揭示基因的表达模式和调控网络。
在表观遗传学研究中，高通量测序技术可以用于DNA甲基化和组蛋白修饰的检测，从而深入了解表观遗传学在基因调控中的作用。
在蛋白质组学研究中，高通量测序技术可以用于蛋白质质谱的分析，帮助鉴定蛋白质的序列和修饰。
高通量基因测序技术的数据分析是测序研究的重要环节之一。
在高通量测序实验中，产生的大量数据需要进行存储、处理和分析。
数据分析的主要目标是从原始测序数据中提取有用的信息。
高通量基因测序数据分析包括数据预处理、序列比对、SNP和InDel检测、基因表达分析、功能注释等步骤。
首先，数据预处理是数据分析的第一步，用于去除测序数据中的低质量读取、接头序列和重复序列。
植物光合作用相关基因的克隆与表达植物光合作用是指在光的作用下，植物体内的叶绿素吸收光能，将其转化成化学能，从而产生能量和氧气的过程。
植物光合作用是生命的基础能量来源之一，也是维持生态系统平衡的重要过程。
植物光合作用的相关基因克隆和表达，是近年来植物学研究的热点之一。
这一研究方向主要集中在植物光合作用的细胞生物学、分子生物学和基因组学等方面。
细胞生物学角度，植物体内的光合细胞有两种类型：一种是负责光合作用的叶绿体细胞，另一种是负责运输产物的质体细胞。
这两种细胞在外形和功能上有所不同，其内部的基因表达和调控也存在差异。
因此，研究植物光合作用相关基因的克隆和表达，需要从细胞类型的角度进行分析。
分子生物学角度，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，主要探索基因的结构、功能和调控等方面。
例如，利用PCR技术和基因克隆技术，可以获得植物体内的光合作用相关基因，然后通过生物信息学工具对基因序列、编码蛋白质和表达谱进行分析。
另外，还可以应用转基因技术构建基因敲除或添加的重组植物株系，进一步揭示光合作用相关基因在植物体内的作用和机理。
基因组学角度，随着高通量测序技术的发展和基因组数据的丰富，研究人员可以在全局范围内分析植物光合作用相关基因的基因组学特征、进化关系和功能注释。
例如，通过对一些重要植物基因的全基因组序列比较，可以发现在多个物种中保守的部位和变异的部位，进而获得这些基因在植物演化中的起源和分化过程。
此外，研究人员也可以利用系统生物学的方法，将各个基因的作用和调控网络进行拼凑和模拟，从而模拟出更加细致的植物光合作用模型。
总之，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，对于理解植物生物学和解决环境保护和农业生产中的问题，具有重要意义。
希望未来能够有更多的研究成果和创新突破。
全基因组测序逐步克隆法的原理与应用全基因组测序逐步克隆法是一种常用的基因分离和克隆技术，常用于鉴定特定基因，并分析其结构和功能。
该方法通过将全基因组DNA进行序列分析，随后通过逐步克隆来分离和克隆目标基因。
下面将介绍全基因组测序逐步克隆法的原理和应用。
原理：全基因组测序逐步克隆法的基本步骤包括：1）全基因组DNA的制备和测序；2）目标基因的定位；3）目标基因的分离与克隆；4）目标基因的鉴定。
1. 全基因组DNA的制备和测序：首先，需要从目标生物体细胞中提取全基因组DNA。
这可以通过化学方法或商业DNA提取试剂盒来完成。
然后，使用先进的测序技术对全基因组DNA进行高通量测序，以获取DNA的完整序列信息。
2. 目标基因的定位：利用全基因组测序得到的数据，通过与已知目标基因的序列比对，可以定位到目标基因在全基因组中的位置。
这有助于后续的分离和克隆工作。
3. 目标基因的分离与克隆：通过目标基因的定位，可以确定其上下游区域，并设计引物。
然后使用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目标基因的序列。
扩增后的产物可以通过凝胶电泳检测，并进行纯化。
随后，将纯化后的目标基因序列与适当的载体（例如质粒）连接，形成重组DNA。
最后，将重组DNA转化入宿主细胞，如大肠杆菌（E. coli）细胞。
通过培养和筛选，可以得到含有目标基因的克隆。
4. 目标基因的鉴定：通过使用限制性内切酶、DNA测序等方法，可以对克隆中的目标基因进行鉴定。
此外，可以利用基因测序技术对目标基因的全序列进行分析。
应用：全基因组测序逐步克隆法在生物学研究和应用中具有广泛的应用。
1. 基因功能研究：通过全基因组测序逐步克隆法，可以鉴定和分离特定基因，进而研究其结构和功能。
这有助于揭示基因在生物体发育、代谢和疾病发生中的作用机制。
2. 基因工程和生物技术：全基因组测序逐步克隆法可以用于将目标基因克隆到适当的载体中，以构建重组DNA。
这有助于基因治疗、转基因作物开发和生物制药等领域的研究和应用。
高通量基因测序技术在动物基因组学研究中的应用随着科学技术不断进步，高通量基因测序技术在动物基因组学研究中应用越来越广泛，为了实现快速、准确、可重复的基因组测序，高通量测序技术已经成为最主要的技术手段之一。
本文将通过几个方面来探讨高通量基因测序技术在具体的动物基因组学研究中的应用。
一、动物遗传变异的检测和全基因组比较分析高通量基因测序技术能够极大地缩短基因测序的时间，同时可以检测到某些普通的基因突变以及复杂性疾病等遗传变异。
这对于进一步了解动物的遗传特征、揭示它们的物种起源、进化以及分布规律十分重要。
例如，在研究根瘤菌和豌豆（Pisum sativum）之间的共生关系中，鉴定两者之间的基因组序列以及代谢途径的遗传变异，使用高通量基因测序技术可以快速且准确地得到结果。
比较不同动物种的基因组序列可以加深我们对动物间遗传差异的认知，发现它们之间的共性和差异性。
此外，在动物基因质量控制过程中，高通量基因测序技术也可以对样本进行评估，发现一些不同的编码序列和不确定性序列，最终得出更加准确的结果。
二、基因编辑技术与基因家族研究高通量基因测序技术可以帮助揭示动物基因编辑技术中的基因变异前后区别，从而获得更好的编辑效果和更准确的选育结果。
同时，该技术还可以通过分析一个基因家族的各个成员之间的亲缘关系，筛选出那些重要的基因家族成员，从而进一步了解它们在动物中的重要性和功能。
例如，通过对鲫鱼的高通量基因测序技术，可以发现它们的光敏感受器基因家族包括两个不同的家族成员，并且这些基因家族与光信号转导过程紧密相关。
这些研究还有助于揭示基因家族在动物进化中的重要性，以及它们在物种之间的遗传变异和适应能力。
三、基因密码和表达谱图的研究高通量基因测序技术可以帮助研究者更加深入地探索动物基因表达谱图的背后。
例如，使用该技术可以对动物中的基因密码进行深入研究，发现那些具有重要的调控信号和功能的序列。
同时该技术还可以帮助确定同一基因在不同个体中发生变异的位置，从而highlight它们在不同样本之间的表达差异。
