胎牛血清,小牛血清,新生牛血清之间的区别,保存及用法

细胞培养的一些问题1. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。

故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~ 一年。

2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。

几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。

谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ◦C冰冻保存，用前加入培养基中。

加有谷氨酰胺的液体培养基4 ◦C冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。

基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。

每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。

包装为粉红色，-24◦C保存。

3.培养用液pH对细胞生长的影响由于，大多数细胞适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。

各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。

但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。

因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。

液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

4.常用培养基及培养用液的渗透压范围培养基名称渗透压范围（mOSM）DMEM（高糖）315 ~ 350DMEM（低糖）270 ~ 330RPMI-1640 260 ~ 290MEM-EBSS 280 ~ 310MEM-NEAA 280 ~ 310McCoy5a 280 ~ 310MEM-a 280 ~ 310M—199 275 ~ 305IMDM 270 ~ 300DMEM/F-12 280 ~ 310F—10 270 ~ 300F—12 275 ~ 300培养基名称渗透压范围（mOSM）L—15 280 ~ 320D-Hanks 280 ~ 300Hanks 280 ~ 300PBS 275 ~ 3005.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。

胎牛血清安全操作及保养规程胎牛血清概述胎牛血清是从母牛胎儿的血液中提取而成的一种血清产品，广泛应用于生物技术、生命科学和医药行业，用于细胞培养、生物反应器和药物研发等方面。

为了确保胎牛血清质量，保证实验的准确性和可重复性，有必要掌握胎牛血清的安全操作和保养规程。

胎牛血清安全操作1. 防止冻融循环尽量避免胎牛血清不必要的冻融循环，因为冻结和融化过程中会造成蛋白质的降解和失活，从而影响胎牛血清的质量。

同时，在使用胎牛血清前，需要将其缓慢回温至室温或体温，避免温度变化过快。

2. 避免过度稀释过度稀释会影响胎牛血清中生物活性物质浓度，如生长因子、激素等，从而对实验造成影响。

因此，在稀释胎牛血清时，需要根据实验需求和胎牛血清质量控制要求进行合理稀释。

3. 防止交叉感染由于胎牛血清可能会携带病毒和细菌等病原体，因此在操作过程中需采取严格的无菌操作。

使用前，应确保胎牛血清和其他材料、器皿均无污染，避免引入细菌和病毒等病原体。

4. 避免超期使用胎牛血清容易受热等环境不良因素影响，在使用过期胎牛血清时可能存在安全隐患和对实验结果的影响。

因此，在使用胎牛血清前需查看生产日期、保质期等相关信息，并在规定的有效期内使用。

胎牛血清保养规程1. 存储温度由于胎牛血清中含有各种生物活性成分，因此在存储时需注意温度控制。

一般建议将胎牛血清存储在-20℃以下的冰箱或液氮箱中，避免其受热、受潮等条件的影响。

2. 避免光照胎牛血清中的生物活性成分容易受到光照的影响，特别是紫外线和可见光。

因此，在存储和搬运过程中，应避免让胎牛血清暴露在阳光下或强光照射下。

3. 适当搬运胎牛血清属于易碎、易受污染的物品，因此在搬运过程中需轻拿轻放、避免摔打和碰撞。

同时，在与其他物品共存储时，需放置在单独的货架或箱子中。

4. 定期检查为确保胎牛血清的质量，需要定期检查质量标准和存储条件等，如检查冷冻设备是否正常运行、标签信息是否正确、保存时间等。

同时，发现质量问题应及时处理或报告相关人员。

fbs灭活温度FBS，也就是胎牛血清，是目前生命科学领域中使用最广泛的细胞培养基添加物之一，它含有许多活性生物分子。

在实验室应用中，研究人员常会使用FBS来培养悬浮在生长培养基中的细胞，以促进它们的生长和分裂。

而在使用FBS的过程中，为了确保实验得到准确可靠的结果，灭活FBS就成为一项必不可少的工作之一。

而灭活温度就是在灭活FBS过程中需要考虑到的指标之一。

FBS的灭活温度是指在给定的时间内，利用一定的温度将所需要灭活的FBS进行处理，使其中的生物活性分子得到破坏或去活化，从而不会对实验结果产生负面影响。

在实验室中，我们经常使用FBS来培养细胞，但是FBS中所含有的生物活性分子和细胞因子等是否对细胞的生长与发育产生干扰，就是科学家们非常关心的问题，因此在使用FBS进行实验之前，必须进行灭活。

同时，不同的实验需要灭活的温度也有所不同，这与具体的研究目的、研究对象以及实验条件等因素有关。

在一般实验条件下，FBS的灭活温度一般为56℃，处理时间为30分钟。

这种温度和时间的灭菌处理可以起到有效的去活化作用，可以除去其中的病毒、细菌等微生物，同时也可以破坏其中的细胞因子和生长因子等生物活性分子，使其失去原有的生物活性。

但是在一些特殊的实验条件下，研究人员需要使用更高的灭菌温度和更长的处理时间，以保证FBS中的生物活性分子被彻底破坏。

尽管在56℃的灭菌温度下，FBS中的活性分子会被有效去活化，但也有些分子可能会出现部分失活或仍然保留一部分活性的情况。

因此，在使用FBS进行实验时，还需要进行一定的质量控制和质量保证。

例如，科学家们在选择FBS时，会根据其保证质量的厂商和品牌进行选择，同时在使用前还需要进行生物学和化学检测，以确保其中不包含有对实验有干扰作用的生物活性分子。

总体而言，FBS灭活温度的选择需要综合考虑实验条件、实验需求和研究对象等因素，进行适当的调整和优化，从而保证实验结果的可靠性和准确性。

在进行实验前，一定要仔细了解和掌握所要使用的FBS 的特性和品质，并进行灭活处理和质量检测工作，以避免实验结果受到干扰和误差。

中国牛血清行业现状显示，牛血清是血清的一种，是一种浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，内含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性起到生理平衡作用。

不同年龄的牛采血得到的血清也不相同。

目前大体上有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清及成年牛血清4类。

一、目前血清市场上胎牛血清（FBS）是最常用的血清添加剂血清指血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体，提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和生长因子，使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。

血清种类多样，主要有胎牛血清、透析型胎牛血清、天然低IgG胎牛血清、干细胞培养胎牛血清、特殊用途胎牛血清、活性炭/葡萄糖处理胎牛血清、胎牛血清替代物、小牛血清、新生牛血清、加强型小牛血清、补铁小牛血清、成牛血清、供体马血清、兔血清、鸡血清、猪血清、马血清、其他动物血清以及合成血清替代品等。

近年来随着包括中国在内的新兴国家发展迅速，为缩小与发达国家在尖端技术方面的差距，逐步加大生命科学领域的科研投入。

与此同时，随着生物技术在引领未来经济社会发展中的战略地位日益凸显，国家先后出台一系列鼓励政策和措施，积极鼓励全社会在生命科学领域进行研究，中国生命科学领域的研究资金投入迅猛增长。

目前中国生命科学投入增速领跑全球。

数据显示，2019年中国生命科学领域研究资金投入从2015年年的434亿元增长至866亿元，年复合增长率高达18。

8%；估计2020年中国生命科学领域研究资金投入在948亿元，并预计2021年将达到1056亿元。

而随着生命科学产业的发展，中国生物制药培养基的市场规模也在不断增长。

数据显示，2020年中国生物制药培养基的市场规模为44亿元，预计2025年将达到84亿元，年复合增长率将达到29。

0%。

随着中国生物制药培养基的市场规模也在不断增长，从而推动了中国细胞培养中血清的需求量持续增长。

胎牛血清使用注意事项
近年来全球疫情频发，很多都是动物来源的病毒传播，我国对于动物源制品的进口一直有很严格的规定，而对于疫区来源的胎牛血清，同样存在较大的生物学污染风险，比如病毒、支原体、噬菌体污染等。

这对于使用血清进行科研的实验操作人员造成了重大的潜在隐患，因此，国内官方对此也有明确的公告：未经检疫的胎牛血清可能携带传染性物质，一旦流入境内，将会对人民群众的生命健康造成重大威胁，如可能带有疯牛病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、狂犬病毒或其他传染性物质，具有极高的检疫风险。

此外，不合格的血清对实验的重复性、稳定性和真实性也会造成严重影响。

1）无合格质检的胎牛血清存在支原体、病毒等污染，这对涉及细胞培养的实验结果会造成不良影响；
2）采血工艺不规范导致溶血，溶血较严重的血清含有许多胞内产物，对细胞有刺激作用，影响实验的稳定性和数据的真实性；
3）血清批次不稳定，实验结果难以重复。

血清使用说明胎牛血清与小牛血清某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可。

储存条件血清一般储存于－20℃，同时应避免反复冻融。

若存放于4℃时，请勿超过一个月。

血清中絮状沉淀的处理沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白，这是正常特性，不会影响产品性质。

离心血清（400g，1-2分钟）或简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里。

大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。

一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤。

使用浓度一般为5－20％，最常用是10％。

过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。

解冻方法血清从冰箱取出后应慢慢地解冻。

最好在4℃低温冰箱里放置一天或直到完全融化为止。

如果时间不允许低温解冻, 可参考以下解冻方法：1. 将血清从冰箱里取出后，在室温下放置15-20分钟。

2. 然后将血清放置在37℃水浴槽里。

过高温度会导致血清出现浑浊现象。

不要让水淹没装有血清的瓶子。

3. 每隔5分钟左右适当摇晃瓶子，直到完全地解冻为止。

热灭活方法加热可以灭活补体系统。

激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。

在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

1. 用上述描述的方法将血清在低温冰箱或室温下解冻。

2. 在血清解冻时，将一个容器装入适量的水，用于模拟装有血清瓶子在热处理过程中检测瓶内水的温度。

容器大小、质地和装水的量最好与装血清的瓶子相同或相似。

3. 待血清彻底解冻时，将含有血清的瓶子放在预热的56℃水浴里，不要将含有血清的瓶子让水淹没或接近瓶子的盖子，以免导致污染。

4. 在开始加热处理时，要及时使用温度计测定模拟瓶内水的温度。

细胞培养血清使用方法一、细胞培养血清的选择1.获取合适的细胞培养血清：在选择细胞培养血清时，应根据细胞类型和培养需求来选择适合的血清种类。

常见的细胞培养血清包括胎牛血清(FBS)、小牛血清(CS)、羊血清(GS)等。

2.质量检测：在使用细胞培养血清前，应进行必要的质量检测。

常见的检测项目包括细胞毒性检测、内毒素检测、抗体检测等，以确保细胞培养血清的质量符合要求。

二、细胞培养血清的保存与预处理1.储存温度：细胞培养血清应保持在-20℃以下的低温环境中保存，避免冻融过程中引起的细胞因子等成分的损失。

2.解冻方法：在使用前，需要将细胞培养血清从冷冻状态解冻。

解冻时应将血清瓶或管直接放入37℃的水浴中，待完全解冻后再使用。

避免频繁冻融对细胞培养血清质量造成影响。

3.灭菌处理：为防止细胞培养血清中的微生物污染细胞培养系统，使用前应对血清进行灭菌处理。

常见的方法有过滤灭菌和紫外线灭菌等。

三、细胞培养血清的使用方法1.添加量：在培养基中添加适量的细胞培养血清，通常按照5%-20%的比例添加，视细胞类型、生长阶段和实验要求而定。

同时，将血清的添加量逐渐减少，有助于维持细胞类型和稳定细胞表型。

2.血清浓度试验：在初始阶段的细胞培养中，可以进行不同浓度细胞培养血清的试验，以确定最适合细胞生长和增殖的血清浓度。

3.细胞分配与传代：在细胞传代过程中，应根据细胞的生长情况和实验要求，精确计算和添加细胞培养血清的量。

通常情况下，传代时应先将细胞离心，去除老化的细胞和细胞碎片，再将新鲜培养基补充到细胞中，继续传代和培养。

四、细胞培养血清的注意事项1.避免重复冻融：频繁冻融对细胞培养血清质量会有影响，因此在使用前需要根据实验需求，将血清储存和使用合理安排，避免过多的冻融过程。

2.避免污染：在使用细胞培养血清时，应注意防止污染对细胞培养的影响。

避免细菌、真菌和其他微生物的污染，同时在操作过程中注意无菌操作，避免引入外源性污染。

3.使用正常生长因子替代：部分细胞类型在一定条件下可以使用无血清培养基进行培养，无血清培养基中含有正常生长因子的替代物，能够促进细胞的生长和增殖。

血清相关知识总结。

使用胎牛血清的注意事项：血清是细胞培养中最重要的元素之一。

下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：1、保存血清最好的方法：建议血清应保存在-5℃至-2O ℃。

然而，若存放于4 ℃时，请勿超过一个月。

若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。

但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。

但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：一般是以56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有: 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活：有必要做热灭活吗？实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。

如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！6、血清相关知识：如何避免沉淀物的产生？我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。

细胞培养，血清VS无血清！细胞在体外能够成功生长，培养基的选择及培养方法的优化十分关键。

细胞在单纯的培养基中不能存活，各种类型的细胞培养中必须提供某些生长因子、黏附和伸展因子、微量元素等营养物质。

传统培养基中一般会添加动物血清如牛血清等。

胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。

其中胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

血清培养的优势与局限采用天然来源的血清作为细胞培养添加物，优势在于提供丰富全面的细胞生长必需的营养，并且提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，调节其活性。

结合蛋白还能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

血清还是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

但血清的使用也存在一定局限性。

(1)血清可能含有细胞生长抑制因子和毒性因子，存在潜在毒性；(2)血清的获取成本高，价格较为昂贵；(3)血清由于成分不完全明确，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞表达目的产物纯化等下游操作带来困难。

无血清培养优势由于常规血清培养基存在上述问题，近年来无血清培养基越来越受到重视，其开发和应用渐成趋势。

无血清培养基不含动物血清或其他生物提取液，仍可使细胞在体外较长时间生长、增殖或维持。

无血清培养基可以针对特定的细胞类型配制专用的培养基，如爱必信生物研发推出的人间充质干细胞培养基，可以帮助精确地控制细胞的增殖和分化过程等。

无血清培养基尤其应用于哺乳动物细胞的大规模工业培养。

同时，它也是研究细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的有力工具。

无血清培养基具有以下优点：(1)其组成明确，可避免血清不同批次带来的质量变动，提高可重复性。

(2)避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染风险。

(3)避免血清不明组分对实验研究的影响。

(4)有利于体外培养细胞的分化。

(5)可提高细胞产物的表达水平并易于纯化。

附录ⅩIII D新生牛血清检测要求本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。

牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。

新生牛血清用于生产前应逐批进行以下检查，并应符合规定。

蛋白质含量应为3.5%～5.0%（附录ⅥB第一法）。

血红蛋白用氰化高铁法或其他适宜的方法测定。

应不高于0.02%。

大肠杆菌噬菌体采用噬斑法和增殖法检测。

不得有噬菌体污染。

摩尔渗透压（指标待定）无菌检查依法检查，应符合规定（附录ⅫA）。

支原体检查依法检查，应符合规定（附录ⅫB）。

细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（附录Ⅻ E 凝胶限量试验）。

病毒检查1. 细胞培养法（1）非血吸附病毒检查将新生牛血清供试品分别接种到人源（如人二倍体细胞）、猴源（如V ero细胞）以及牛肾传代细胞三种细胞，采用的牛肾传代细胞系应证明无牛病毒的污染。

每种细胞至少接种6瓶，每瓶细胞悬液接种量不少于培养液总量的25%。

于36±1℃培养21天。

接种的每种细胞都应同时设立牛血清阴性对照和病毒阳性对照，（阴性对照用牛血清应证明无牛病毒污染）。

培养过程中可根据细胞生长情况更换细胞培养液，每次更换培养液前应观察（肉眼/显微镜）有无细胞病变出现。

培养到期后，阴性对照应无任何细胞病变出现，阳性对照应出现典型的细胞病变，试验成立。

供试品检查应不出现任何细胞病变为阴性，符合要求。

（2）血吸附病毒检查将上述接种供试品的每种细胞取2瓶进行血吸附病毒检查。

用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于细胞表面，置2~8℃分钟，然后置20~25℃30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，供试品检查结果均应为阴性。

试验同时应设立血吸附阳性对照。

2. 免疫荧光抗体检查法采用直接或间接免疫荧光抗体检查法，至少应对牛腹泻病毒，牛腺病毒、牛细小病毒、呼肠孤病毒、狂犬病病毒以及牛副流感病毒进行检查，结果均应为阴性。

支持细胞增殖检查用Sp2/0 -Ag14或适宜的非贴壁传代细胞进行。