第二章-流加发酵与高密度培养

高密度培养应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。

现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。

基本信息中文名高密度培养发展基础基因工程菌生产多肽类药物应用领域生物制药代表人生长激素技术介绍现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。

例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。

具体方法（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。

（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。

（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。

（4）防止有害代谢产物的生成。

高密度培养过程中培养基成份及作用：根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。

一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。

有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。

当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。

在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。

然而。

半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。

碳源Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。

还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。

除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。

培养基中的碳源浓度相当重要。

如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。

⼤肠杆菌发酵经验总结⼤肠杆菌发酵经验总结⾸先，补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量（主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量，进⽽影响），所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率，对于控制⼄酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充⾜的溶氧，并严格控制pH值，⽽且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的，⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间⾮常重要，⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期，⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋⽩的⾼表达；2.已经得到了⼤量的菌体，⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定，不论是从动⼒学⾓度，还是能耗，物料成本⽅⾯，都⽐较合理。

第四，补料过程中的碳氮⽐也很重要。

若氮源过⾼，会使菌体⽣长过于旺盛，pH偏⾼，不利于代谢产物的积累，氮源不⾜，则菌体繁殖量少从⽽影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体⽣长，碳源不⾜，则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。

另外，碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质，从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。

根据⾃⼰的经验，⼀般情况下，对于⼀个稳定的发酵⼯艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。

可以适当调整碳氮⽐。

⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。

⼀、代谢副产物-⼄酸⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。

当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。

发酵工艺优化前言：发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.一、发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。

在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。

发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。

为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。

而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。

发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。

温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。

同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。

因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。

例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。

注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!二. 好氧发酵1. PH工艺的优化2. 溶氧工艺的优化3.原材料工艺的优化4.消毒(灭菌)工艺的优化5.菌种制备工艺的优化6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化7.成本工艺优化8.种子罐工艺的优化9.发酵罐工艺参数控制的优化10.仪表控制的工艺优化11.环境的工艺优化12.染菌处理的工艺优化13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)14.补料工艺的优化15.倒种工艺的优化16发酵设备的工艺优化17.其他的工艺优化三. 厌氧工艺的优化四.固体发酵的工艺优化五.其他1. PH工艺的优化A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测.C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的PH,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PHH.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.六、A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。

一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法酿酒酵母是一种重要的微生物资源，广泛应用于酿造行业。

高密度发酵培养是提高酿酒酵母生产效率的关键技术之一。

本文将介绍一种高密度发酵酿酒酵母的培养方法。

首先，酿酒酵母的培养基是高密度发酵的关键。

传统的酵母培养基主要由碳源、氮源、无机盐和微量元素组成。

在高密度发酵中，碳源的选择对提高酵母生长速度和酒精产生率很重要。

常用的碳源有葡萄糖、麦芽糖和淀粉等。

氮源是合成蛋白质和酵母细胞增殖的关键，常用的氮源有尿素、酵母浸渍物和氨态氮等。

在培养基中添加适量的无机盐和微量元素可以提供必需的元素，维持酵母细胞的正常生长和代谢活动。

其次，培养条件的调控对高密度发酵效果也有影响。

温度是控制酵母生长速率和代谢的重要因素，一般酿酒酵母的适宜培养温度为28-32摄氏度。

pH值是影响酵母生长和酒精产生的重要因素，常规条件下酵母培养基的pH值在4.5-5.5之间。

通风条件也是高密度发酵的重要指标，合理的通风条件有利于提供足够的氧气，促进酵母的代谢活动。

此外，酿酒酵母的菌种的选取也是高密度发酵成功的关键。

目前常用的菌种包括酒链球菌、面包酵母等。

选取适宜的菌株是提高高密度发酵效率的前提，菌株应具有良好的生长能力和耐受性，能够在高浓度的酒精环境中生存和繁殖。

最后，监控和调控发酵过程对高密度发酵的成功也至关重要。

通过监测酵母生长曲线、酒精产量和其它重要的发酵参数，可以及时发现并纠正发酵过程中的问题，提高发酵效果。

在发酵过程中，定期采集发酵液进行物理化学分析和微生物检验，以确保发酵过程的有效控制。

综上所述，高密度发酵是提高酿酒酵母生产效率的重要手段之一。

通过优化培养基组成、调控培养条件、选用合适的菌株以及监控和调控发酵过程，可以取得较高的发酵效果。

酒精工业可以借鉴这些方法，提高酿酒酵母的生产效率，推动酒精工业的可持续发展。

微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。

单位：细胞干重/升（DCW/L）。

凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。

定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。

用途[1]各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。

发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。

随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。

但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。

谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。

迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。

流加培养名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流加培养作为生物学和微生物学领域的一种培养方法，是一种通过提供适当的培养基和环境条件来满足细胞或微生物生长和繁殖的需求的过程。

它是一种广泛应用于实验室和工业生产中的技术，对于研究生物学和微生物学以及制造生物制品具有重要意义。

流加培养的基本原理是通过向培养基中连续添加新的培养液来维持细胞或微生物的生长。

在流加培养中，培养液会通过一个进料管源源不断地被加入到培养基中，而废液则通过排液管定期排除。

这种持续供给新鲜培养液和同时排除废液的过程，使得培养物中的养分始终处于较高的浓度，同时也有效地去除了代谢产物和有害物质，为细胞或微生物的生长提供了一个良好的环境。

流加培养广泛应用于许多领域，包括生物技术、生物制药和科学研究等。

在生物技术领域，流加培养被用于生产重组蛋白、表达目的蛋白以及制造生物燃料等。

在生物制药领域，流加培养可以用于生产抗生素、疫苗和其他生物制剂。

在科学研究中，流加培养被用于研究细胞生长和发育、细胞代谢以及微生物的生理学等。

尽管流加培养在许多方面具有优势，但也存在一些缺点。

流加培养的设备和操作相对复杂，需要一定的技术支持和成本投入。

此外，对于某些细胞或微生物来说，流加培养可能无法提供最适宜的生长环境。

因此，在选择培养方法时，需要根据具体的需求和实际情况进行权衡和选择。

综上所述，流加培养作为一种常用的生物学和微生物学培养方法，在实验室和工业中具有广泛的应用。

通过提供连续的培养液供给和废液排除，流加培养为细胞和微生物的生长提供了一个稳定和良好的环境。

然而，在实际应用中也需要考虑到其设备复杂性和适用性。

1.2文章结构文章结构部分内容：在本文中，我将按照以下结构来组织和呈现关于流加培养的相关内容。

首先，在引言部分，我会对流加培养进行概述，介绍其基本概念和背景。

接着，我会详细阐述本文的结构，包括各个章节的内容和组织方式。

最后，我会明确阐明本文的目的和意图。

大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。

第四，补料过程中的碳氮比也很重要。

若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。

另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。

根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。

可以适当调整碳氮比。

大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。

一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。

当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。

许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。

由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。

所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。

本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。

1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。

不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。

这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。

业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。

发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。

接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。

接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。

且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。

一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。

种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。

如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。

工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。

2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。

有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。

如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。

大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。

第四，补料过程中的碳氮比也很重要。

若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。

另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。

根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。

可以适当调整碳氮比。

大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。

一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。

当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。