image J 软件分析双标及多标格免疫荧光共表达操作步骤2

如何使用ImageJ 测量荧光强度上一篇小编给大家分享了一下细胞计数方法，今天小编给大家分享一下期待已久的荧光定量分析。

荧光定量分析是生物图像处理中比较常见的一种，今天我们分享的如何使用ImageJ 进行荧光定量分析。

下图就是在我们我们Revolve 正倒置一体显微镜上拍摄的照片，以此图为例来说明如何进行荧光定量分析。

拆分多通道图像荧光强度的测量无法在同时显示多通道的Merge 图像中进行，在进行测量之前应该先把Merge 的图像拆分成单通道（或者直接对单通道图片进行测量）。

拆分方法：Image →Color →Split Channels。

图像分割在图像计算的角度而言，图像分割（Image Segmentation）便是将图片分割为多个片段的过程，其目的是简化图像不同部分的象征意义以便于图像分析。

常用的图像分割技术主要用来定位图像中的目标物体并勾画出其边界。

ImageJ中可通过多种方法实现图像分割，在此我们先介绍一下最基本的一种-手动图像分割。

此种方法主要通过控制图像直方图中的强度阈值来实现，分割出阈值范围内的图像区域，并进行后续的测量分析。

实现方法：Image→Adjust→Threshold，红色蒙版即代表选中区域。

测量荧光强度实现方法：Analyse→Measure。

注意：默认数值显示的是整张图片的荧光强度和面积，我们需要进行参数设定才可以显示所选区域的统计值。

如果需要导出数据或者设定测量参数，点击右键（也可以通过Analyse→Set Measurement实现），选中Limite to threshold和Area fraction。

好啦，现在进行Analyse→Measure，就可以得到想要的统计值了。

免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。

b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。

2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。

b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。

3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。

4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。

5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。

6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。

7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。

8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。

9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。

10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。

注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。

2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。

3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。

4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。

5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。

6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。

imagej的使用方法
ImageJ是一款功能强大的图像处理软件，可以帮助用户轻松地进行图像的测量、分析、编辑等操作。

本文将指导用户如何使用ImageJ来处理图像。

首先，用户需要下载ImageJ软件，然后将图像导入ImageJ中。

用户可以选择从本地文件夹中导入图像，也可以从网络中导入图像，比如URL、FTP等。

接下来，用户可以通过ImageJ的图像处理功能对图像进行处理。

用户可以根据自己的需要调整图像的亮度、对比度、饱和度等参数。

此外，ImageJ还支持用户对图像进行滤镜处理、裁剪、旋转和缩放等操作。

同时，ImageJ还支持用户对图像进行测量和分析。

用户可以通过ImageJ的测量工具来测量图像中的面积、长度和角度等信息。

此外，ImageJ还拥有强大的图像分析功能，可以帮助用户分析图像中的细节信息，提取出图像中的特征和目标。

最后，用户可以通过ImageJ对图像进行编辑。

ImageJ提供了大量的编辑工具，可以帮助用户轻松添加文字、图标、标签等内容，以增加图像的可读性。

总之，ImageJ是一款强大的图像处理软件，可以帮助用户轻松地
进行图像的测量、分析、编辑等操作。

通过本文的指导，用户可以轻松地使用ImageJ来处理图像。

1、安装后首先打开ImageJ：2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。

因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold （这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set在弹出来的界面点击OK9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）10、记录数据并计算：结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。

作图软件：Image J介绍：该软件可以计算选定区域内分析对象的一系列几何特征，分析指标包括：长度，角度，周长，面积，长轴，短轴，圆度等。

参考：解螺旋-套路课01-第三章-第3节两种应用：免疫组化定量分析，计数免疫组化定量分析3种方法：手动、自动1、自动2【1】手动定量1.打开图片File –open –找到图片2.选择完所有阳性结果后，再同一进行计算Analyze –tools –ROI manger（感兴趣区域）然后标签栏选择第3个标签（以任意形状选取感兴趣区域）【2】自动定量11. 打开图片File –open –找到图片2. 彩图转换为8bit灰度图Image –type –8-bit3. 设定阈值Image –adjust –threshold系统会自动设定一个阈值，并将阈值之上的面积进行统计，此时打开免疫组化原始图片，手动调节阈值大小，当我们设定的阈值能够比价好的反应免疫组化的生物学意义时，就使用此时的阈值统计4. 统计Analyze –measure得到4个参数：area(阳性区域总面积)，mean(平均光密度)，min(最小光密度)，max(最大光密度)，后续作图用。

【3】自动定量21. 打开图片File –open –找到图片2. 彩图转换为RGBImage –type –RGB stack在得到的图片中，通过拖动下方的进度条，选取对比度最显著的那张3. 设定阈值Image –adjust –threshold系统会自动设定一个阈值，并将阈值之上的面积进行统计，此时打开免疫组化原始图片，手动调节阈值大小，当我们设定的阈值能够比价好的反应免疫组化的生物学意义时，就使用此时的阈值统计4. 统计Analyze –measure得到4个参数：area(阳性区域总面积)，mean(平均光密度)，min(最小光密度)，max(最大光密度)，后续作图用。

计数例如：克隆形成实验定量分析两种方法：手动计数、自动计数【1】手动计数1. 打开图片File –open –找到图片2. 点击工具栏第7个按钮“多点计数工具”在每个克隆上进行点击，每点一下，图上就会多一个软件加上的点3. 所有的点都选上之后，点击analyze –measure软件会生成一个结果图拉到最下面，就可以看到一共有多少点【2】自动计数1. 打开图片File –open –找到图片2. 彩图转换为8bit灰度图Image –type –8-bit3. 设定本张图中最大克隆和最小克隆设置最大克隆：点击工具栏第3个按钮，然后圈出本图中最大的克隆，再analyze –measure，看这个克隆的面积，例如area = 276设置最小克隆：点击工具栏第3个按钮，然后圈出本图中最小的克隆，再analyze –measure，看这个克隆的面积，例如area = 544. 设定阈值Image –adjust –threshold系统会自动设定一个阈值，并将阈值之上的面积全部用红色标记如果不合适，可手动调节因为阴影的存在，软件把这些阴影也识别为阳性结果，我们需要通过对克隆大小的限定，从而将阴影排除在阳性结果之外5. 通过对克隆大小的限定，从而将阴影排除Analyze –analyze particles在size（pixel^2）处填入克隆的大小范围，结合第3步的结果设置：30---300，点击“OK”这样，阴影就被排除了6. 拉到最低，便可以看到克隆的数量。

ImageJ这套软件可以自动帮你你计算细胞数，也可以定量分析DNA电泳或是Western blot条带。

step 1.首先打开软件后，开启图档ImageJ这套软件可以自动帮你你计算细胞数，也可以定量分析DNA电泳或是Western blot条带。

step 1.首先打开软件后，开启图档step 2.请先做校正，选择Analyze底下的Calibrate选项，再选择校正的模式，使用Uncalibrate OD，再按ok按下ok之后会出现校正的图形Step 3.在要分析的第一条(first lane)加上一个长型框(工具列第一个选项)，再按下Analyze/Gels/select first Lane快速键(Ctr+1)，此时框架中会出现一个号码1，之后可以移动框架到第二个lane再选择Analyze/Gels/select second Lane快速键(Ctr+2)，当然可以一直加下去，最后按Analyze/Gels/plot Lanes快速键(Ctr +3)。

Step 4.分析以后会出现图型表示你刚选择的框内的影像强度，此时可以看到有几个比较高的区段，就是我们想定量的band，使用直线工具(工具列第五个选项)先将图形中高点为有band的区域和没有band的区域分开再，使用魔术棒工具(工具列第八个选项)点选要分析的区域。

Step 5.当我们点选分析时，在result的对话视窗会出现分析的数据，依序点选就会出现每个band的值。

注：当我们选择分析的条带也可以是横向选取，就可以只比较相同大小的DNA 的含量，同样也可以应用在western blot或其它类似实验条带的分析上。

使用ImageJ 分析图像中的颗粒数[] 原创教程，转载请保留此行1，到本站资料下载-实用小工具栏目下载 ImageJ 并安装。

2，打开ImageJ并打开要分析的图片。

请看演示图片。

3，把图像二值话或者设定阈值。

选择Image - Adjust - Threshold...根据提示设定你需要的阈值。

imagej基本操作
ImageJ是一个强大的图像处理软件，以下是其基本操作：
1. 打开图像：选择“File”菜单中的“Open”选项，然后选择要打开的图像文件。

2. 图像显示：在“Display”菜单中选择不同的颜色通道或颜色模式来显示图像。

3. 调整图像大小：选择“Image”菜单中的“Resize”选项，然后输入新的图像大小。

4. 裁剪图像：选择“Edit”菜单中的“Crop”选项，然后选择要裁剪的区域。

5. 调整亮度/对比度：选择“Image”菜单中的“Adjust”选项，然后选择“Brightness/Contrast”进行调整。

6. 滤镜处理：选择“Process”菜单中的“Filter”选项，然后选择不同的滤镜进行处理。

7. 测量工具：选择“Analyze”菜单中的“Measure”选项，然后选择要测量的长度、角度等参数。

8. 绘制线条或标记：选择“Draw”或“Label”工具，然后在图像上绘制线条或标记。

9. 保存图像：选择“File”菜单中的“Save As”选项，然后选择要保存的文件格式。

10. 退出程序：选择“File”菜单中的“Exit”选项，然后保存所有未保存的更改。

以上仅是ImageJ的基本操作，它还有更多高级功能和工具，可以进一步探索并掌握。

免疫荧光双标操作方法及注意事项在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。

(1) 直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体( 如抗 A 和抗 B) 以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2) 间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油： 0.01M PBS (1 ：1)。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5 、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6 、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于4℃保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2 、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清 +荧光标记物 ;(2) 阴性对照：阴性血清 +荧光标记物 ;(3) 荧光标记物对照： PBS+ 荧光标记物。

1. 从image J官方网站下载该软件，切记一些重要的相关的插件要一并下载，如colocalization-finder插件等，存在在安装目录下，否则，有些功能无法找到。

2.将要分析的图片文件打开，出现如下画面时，将一些勾勾去掉，这样的话，一张含有多通道的免疫荧光源图片只以一张图片出现，而不会出现每一种荧光分别就会有一张图片，这对后面选取目的区域是非常有利和方便的。

注意：需要先将图片转换为TIFF格式，否则好像
不能用于分析。

3. 打开图片后，将图片转换为8-或者16-bit。

4. 为了便于分析和观看，可以在image根据栏里选择rotate旋转图片，图中我把图片逆向旋转了90度，见下下图。

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。

ImageJ实⽤技巧——荧光明场图⽚合并和分割（基本功能篇）拍免疫荧光或者荧光转染的时候，⼀定会遇到不同颜⾊荧光照⽚合并与分割，以及荧光和明场照⽚的合并问题。

虽然⼤部分情况下，拍照软件会完成这⼀⼯作，但如果想对某⼀颜⾊的图⽚进⾏修改，然后再合并，或者提取某⼀个通道的照⽚，这时候就需要ImageJ了。

ImageJ中的这⼀功能较为基础，不需要插件，作为基础功能篇的第⼀篇，主要介绍怎么利⽤ImageJ对荧光照⽚合并、分割，以及荧光与明场之间合并。

⼀、不同荧光照⽚合并、分割（1）合并1、打开待合并的图像三张不同颜⾊的荧光图像2、合并不同颜⾊通道（Image-Color-Merge Channels）弹出Merge Channels界⾯：总共有7个颜⾊通道，每个颜⾊选择对应的照⽚，点击OK。

出现合并后的图像（Composite）。

但这时候的合并图像只是三个8-bit的Stacks，如果要保存的话需要把图像转换为RGB模式。

左右调节⼯具条，发现左上⾓的颜⾊信息会变，但是图⽚依然是合并后图像Tips：如果想要更改某⼀颜⾊通道，可以使⽤Channels Tool（Image-Color-Channels Tool），选择不同通道后，对单⼀通道进⾏修改，不影响其他通道。

选择不同Channel，可以呈现不同颜⾊3、⽣成RGB的合并图像（Image-Color-Stack to RGB）⽣成⼀张命名为Composite的RGB图像：命名为Composite的RGB图像注意：这⾥⼀定要Stack to RGB，否则保存后的图⽚并不是Merge后的状态。

4、保存图⽚（File-Save）（2）分割1、打开⼀张RGB图像2、将RGB图像转换为Composite图像（Image-Color-Make Composite）这时候三种颜⾊通道都已经分离出来了。

这⼀步是为了后⾯能直接分割出三个带有伪彩的通道。

如果直接SplitChannels，也会得到三个通道，但是没有伪彩。

这里是它的官网：/ij/正题1、安装后首先打开ImageJ：2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。

因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图：5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global 这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold（这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set在弹出来的界面点击OK9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）10、记录数据并计算：结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。

如何使用ImageJ 测量荧光强度上一篇小编给大家分享了一下细胞计数方法，今天小编给大家分享一下期待已久的荧光定量分析。

荧光定量分析是生物图像处理中比较常见的一种，今天我们分享的如何使用ImageJ 进行荧光定量分析。

下图就是在我们我们Revolve 正倒置一体显微镜上拍摄的照片，以此图为例来说明如何进行荧光定量分析。

拆分多通道图像荧光强度的测量无法在同时显示多通道的Merge 图像中进行，在进行测量之前应该先把Merge 的图像拆分成单通道（或者直接对单通道图片进行测量）。

拆分方法：Image →Color →Split Channels。

图像分割在图像计算的角度而言，图像分割（Image Segmentation）便是将图片分割为多个片段的过程，其目的是简化图像不同部分的象征意义以便于图像分析。

常用的图像分割技术主要用来定位图像中的目标物体并勾画出其边界。

ImageJ中可通过多种方法实现图像分割，在此我们先介绍一下最基本的一种-手动图像分割。

此种方法主要通过控制图像直方图中的强度阈值来实现，分割出阈值范围内的图像区域，并进行后续的测量分析。

实现方法：Image→Adjust→Threshold，红色蒙版即代表选中区域。

测量荧光强度实现方法：Analyse→Measure。

注意：默认数值显示的是整张图片的荧光强度和面积，我们需要进行参数设定才可以显示所选区域的统计值。

如果需要导出数据或者设定测量参数，点击右键（也可以通过Analyse→Set Measurement实现），选中Limite to threshold和Area fraction。

好啦，现在进行Analyse→Measure，就可以得到想要的统计值了。

ImageJ-自动数细胞以及定量分析荧光强度的步骤使用ImageJ软件自动数细胞以及定量分析荧光强度的步骤.ImageJ的主面板:打开文件File ￫ Open ￫’.zvi’先把2D的所有图叠加起来,选项选max intensityImage ￫stacks ￫ 3D project复制一张图:Image ￫duplicate调整Thereshold,实际上是选择想要纳入计算的细胞的区域,选定的区域会用红色高亮标记:Image ￫Adjust ￫ Threshold如果觉得背景太强可减去背景:Process ￫ Subtractbackground当红色高亮标的斑块就是想要的细胞时,点击ApplyImage ￫Adjust ￫ Threshold￫ apply有些细胞叠加,可用watershed自动划为两块斑块.Process ￫ Binary ￫ watershed设定参数,在这里redirected to...不能选择已经标记的这张图,实际上这张已经被转换为二进制图,只有黑和白二色,要选择adjust thereshold之前的那张,这就是为什么3D Z-stack之后要多复制出一张图.Analyze￫Set measurements (Redirected to…greyscale image)然后点击Analyze ￫ Analyze particles我的细胞大小大概是5μm,我手动画了个圈面积大概是250pixel^2,所以这里我选size是250-infinity.因为我只感兴趣荧光平均值,如果要定量细胞大小,可能要选250-350,否则有些叠在一起的细胞会被当做一个细胞来计算Size(pixel^2)=250Soma size=5 μm ^25μm=31.25 pixel5 μm ^2=244pixle^2≈250pixel^2show里面选择outline也很好,可以自动圈出细胞Show: outlines￫ OK过几秒钟,这个图就出来了同时还有result 和summary,是excel 表格,可以保存.然后就可以得到图片中细胞数量,荧光强度平均值,最大最小值等等数据.看这张圈圈图,还是很帅的,呵呵.这些步骤还是很烦的,小水獭刚弄的时候几次想放弃,步骤太多,前后次序不能乱,小水獭表示为什么不能更加简便一些,不就是画圈圈么,汗//b不过处理了50张图以后,小水獭表示短期内还是能记住这些步骤的,于是在博客里保留一个中文使用说明,以助他日之用./thread-210524-1-1.html这篇步骤特别清楚.来自陆绮科学网博客。

Image J在显微成像中的应用介绍1、关于Image JImageJ是一个基于java的公共的图像处理软件，它是由National Institutes of Health 开发的。

可运行于Microsoft Windows，Mac OS，Mac OS X，Linux，和Sharp Zaurus PDA等多种平台。

其基于java 的特点，使得它编写的程序能以applet等方式分发。

ImageJ能够显示，编辑，分析，处理，保存，打印8 位，16 位，32 位的图片，支持TIFF, PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS等多种格式。

ImageJ 支持图像栈（stack）功能，即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个图像，并行处理。

只要内存允许，ImageJ 能打开任意多的图像进行处理。

除了基本的图像操作，比如缩放，旋转，扭曲，平滑处理外，ImageJ还能进行图片的区域和像素统计，间距，角度计算，能创建柱状图和剖面图，进行傅里叶变换。

下载地址：/ij/download.html2、Image 界面界面分为：菜单栏，工具栏和状态栏。

菜单栏菜单栏从左至右分别是：文件，编辑，图形，处理，分析，插件，窗口，帮助。

文件和office word 等软件类似，主要有文件打开，关闭，保存等功能，比较特殊的一个功能是恢复功能（revert），可以直接回到上次保存过的状态。

由于编辑菜单里的取消功能（undo）只能回退一步，所以revert 有时会很有帮助。

编辑Undo, Cut, Copy, Copy to system, Paste, Paste Control.., Clear, Clear Outside, Fill, Draw, Invert, Selection, Options.图像Type（可改变图片格式，如彩色变灰度）, Adjust, Show info, Properties, Color, Stacks, Hyperstacks, Crop, Duplicate.., Rename, Scale, Transform, Zoom, Overlay, Lookup Tables.处理Smooth, Sharpen, Find Edges, Find Maxima, Enhance Contrast, Noise, Shadows, Binary, Math, FFT, Filters, Batch, Image calculator, Subtract Backgroud, Repeat Command.分析Measure, Analyze Particles, Summarize, Distibution, Label, Clear Results, Set measurements, Set Scale, Calibrate, Histogram, Plot Profile, Surface Plot, Gels, Tools.窗口和帮助工具栏工具栏从左至右分别是4种区域选择工具，直线选择工具，角度工具，点工具，魔棒，文字，放大镜，拖手，颜色吸管，动作宏，菜单宏，绘图工具等（颜色吸管以后的内容可以变化，通过点击最右边的>> 按钮选择需要的栏目。

imagej 荧光共标细胞计数荧光共标细胞计数是一种常用的细胞计数方法，通过使用荧光探针标记细胞并利用图像处理软件ImageJ进行分析，可以快速准确地获得细胞数量的信息。

本文将介绍荧光共标细胞计数的原理、操作步骤以及常见应用领域。

我们来了解荧光共标细胞计数的原理。

在进行荧光共标细胞计数前，需要将待测细胞进行染色，并使用荧光显微镜观察。

常用的染色方法包括使用荧光染料，如DAPI、Hoechst等，这些染料可以与细胞核DNA结合，形成荧光信号。

在荧光显微镜下观察时，标记了染色剂的细胞核会发出荧光信号，而未标记的细胞核则不会发出荧光信号。

接下来，我们将使用ImageJ软件进行荧光共标细胞计数。

首先，我们需要打开ImageJ软件并导入荧光显微镜拍摄的图像。

在导入图像后，我们可以使用ImageJ的“阈值”功能将荧光信号与背景分离。

具体操作是在菜单栏中选择“图像”-“调整”-“阈值”，然后根据图像的亮度进行阈值的设定。

设置好阈值后，我们可以通过“分割”功能将细胞区域与背景区域分开。

分割完成后，我们可以使用ImageJ的“分析粒子”功能进行细胞计数。

在菜单栏中选择“分析”-“分析粒子”，然后根据细胞的大小、形状等参数进行设置。

点击“确定”后，ImageJ会自动识别出图像中的细胞并给出计数结果。

同时，ImageJ还可以提供细胞的面积、圆形度等信息。

荧光共标细胞计数在生物医学研究中具有广泛的应用。

例如，在细胞生物学研究中，我们可以通过荧光共标细胞计数来评估细胞增殖、细胞凋亡等细胞活性指标。

在药物筛选领域，荧光共标细胞计数可以帮助我们评估药物对细胞数量的影响，进而评估药物的毒性或抗肿瘤活性。

此外，在免疫学研究中，荧光共标细胞计数也可以用于测定免疫细胞的数量，从而研究免疫反应的程度和特点。

荧光共标细胞计数是一种快速准确的细胞计数方法，通过使用荧光探针和ImageJ软件，可以方便地获得细胞数量的信息。

该方法在细胞生物学、药物筛选和免疫学等领域具有广泛的应用前景。

之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。

ImageJ 共定位分析的网址，插件需在官网下载保存至安装文件夹。

http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/imagej/colour_analysis.htm#coloc_ica 一：共定位scatter plot图(需用Colocalisation Threshold插件)1．使用PS将需要做共定位分析的单个细胞从共染图片中分离出来2.使用Image J打开该图片：File--Open3. 分离荧光通道：Image—Color—Spilt Channels结果会分离出三个荧光通道(blue & green & red),示例图中只有两个荧光通道（red & green），所以blue通道直接删去。

4.作共定位分析：Plugins—Colocalisation Threshold会出现下图的窗口，channel1和channel2选择好red和green通道，勾选show scatter plot,点击ok.结果出现Results和scatter plot窗口，其中Rcolor为Pearson’s for image above thresholds.二共定位的Plot Profile图1.打开需分析的图片，分离荧光通道Split channels ，再合并荧光通道Mergechannels,点击ok.出现Composite窗口，左上角有红色的c1/2字样即为红色通道,滚动滚轮有绿色的c2/2字样此时即为绿色通道。

2.使用直线工具画一条直线，Analyze—Plot Profile,出现下图3.滚动滚轮，在Plot of Composite窗口中选中Live,即可切换到绿色通道的Plotprofile .4.选中List可得到数据，Edit—copy可以将原始数据复制到origin中作图。

5.最后origin做出下图。