荧光特征形式

荧光法荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。

2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。

3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。

（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。

（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。

（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。

（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。

磷光的坡长比荧光更长。

9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。

激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S1的最低振动能级。

②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。

③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。

10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。

1 荧光定义某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。

可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。

2 荧光分类由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。

按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。

3 光致荧光机理某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。

分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。

光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。

分子受激发过程在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。

分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。

跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。

分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。

在电子激发态中，存在多重态。

多重态表示为2S+1。

S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。

S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态，用Si 表示，由此可推出，S即为基态的单重态，S1为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。

S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用Ti 来表示，T1即为第一激发态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。

二苯乙烯（Stilbene 101）是一种常用的有机荧光探针，其分子结构中含有共轭双键系统，这使得它在紫外到可见光范围内具有明显的吸收和发射特性。

荧光光谱是通过测量样品吸收光后发射的光来得到的，这种发射是荧光的特征表现形式。

对于二苯乙烯而言，其最大吸收波长通常出现在280-290纳米之间，这是由于其分子结构中的共轭双键系统对特定波长的光产生电子跃迁所致。

当激发光的光子能量被分子吸收后，电子会从基态跃迁到一个较高的激发态。

随后，电子会回到基态，但在返回过程中会以荧光的形态释放出部分能量，这部分能量通常以较激发光波长长的波长发射出来。

二苯乙烯的最大发射波长通常位于300-400纳米范围内，具体的发射波长取决于分子中共轭系统的长度以及分子所处的环境。

荧光光谱的峰值位置、强度以及寿命都可以提供有关分子环境的信息，例如溶剂极性、温度和周围分子的相互作用。

在实际应用中，二苯乙烯的荧光特性可用于研究生物分子的环境变化、监测化学反应的动力学以及作为光物理和光化学研究的模型分子。

通过分析荧光光谱，研究者可以获得有关分子环境及其动态变化的详细信息。

荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。

在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。

跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。

由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。

荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。

物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。

如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。

实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。

在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。

在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。

激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。

对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。

原子荧光光谱法原子荧光谱（AFS）是介于原子发射光谱（AES）和原子吸收光谱（AAS）之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：基态原子（一般蒸气状态）吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态，而后激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光。

一、原子荧光光谱法原理1．1原子荧光的类型以及荧光猝灭（1）共振荧光当原子受到波长为入A的光能照射时，处于基态E0（或处于E0邻近的亚稳态E1）的电子跃迁到激发态E2,被激发的原子由E2回到基态E0（或亚稳态E1）时，它就放出波长入F的荧光。

这一类荧光称为共振荧光。

（2）直跃线荧光荧光辐射一般发生在二个激发态之间，处于基态E0的电子被激发到E2能级，当电子回到E1能级时，放出直跃荧光。

（3）阶跃线荧光当处于激发态E2的电子在放出荧光之前，由于受激碰撞损失部分能量而至E1回到基态时，放出阶跃线荧光。

（4）热助阶跃线荧光原子通过吸收光辐射由基态E0激发至E2能级，由于受到热能的进一步激发，电子可能跃迁至E2相近的较高能级E3,当其E3跃迁至较低的能级E1（不是基态E0）时所发射的荧光称为热助阶跃荧光。

小于光源波长称为反stoke效应。

（5）热助反stokes荧光（略）某一元素的荧光光谱可包括具有不同波长的数条谱线。

一般来说，共振线是最灵敏的谱线。

处于激发态的原子寿命是十分短暂的。

当它从高能级阶跃到低能级时原子将发出荧光。

M*TM+hr除上述以外，处于激发态的原子也可能在原子化器中与其他分子、原子或电子发生非弹性碰撞而丧失其能量。

在这种情况下，荧光将减弱或完全不产生，这种现象称为荧光的猝灭。

荧光猝灭有下列几类型：1）与自由原子碰撞M*+X=M+XM*T激发原子X、MT中性原子2）与分子碰撞M*+AB=M+AB这是形成荧光猝灭的主要原因。

AB可能是火焰的燃烧产物；3）与电子碰撞M*+e-=M+E-此反应主要发生在离子焰中4）与自由原子碰撞后，形成不同激发态M*+A=M x+AM*、M x为原子M的不同激发态5）与分子碰撞后，形成不同的激发态M*+AB=M x+AB6）化学猝灭反应M*+AB=M+A+BA、B为火焰中存在的分子或稳定的游离基2．荧光强度与分析物浓度间关系原子荧光强度I f与试样浓度C以及激发态光源的辐射强度I0存在以下函数关系I f二①I根据比尔一朗伯定律厅叫口•e-KLN]式中：①-原子荧光量子效率I-被吸收的光强I0-光源辐射强度K一峰值吸收系数L一吸收光程N一单位长度内基态原子数按泰勒级数展开，当N很小，则原子荧光强度I f表达式可简化为：I f二①I0KIN当所有实验条件固定时，原子荧光强度与能吸收辐射线的原子密度成正比，当原子化效率固定时，I f与试样浓度C成正比，即I=aC f上式线性关系，只在浓度低时成立。

个空穴，使整个原子体系处于不稳定的激发态，激发态原子寿命约为10-12-10-14S ，然后自发地由能量高的状态跃迁到能量低的状态。

这个过程称为驰豫过程。

驰豫过程既可以是非辐射跃迁，也可以是辐射跃迁。

当较外层的电子跃迁到空穴时，所释放的能量随即在原子内部被吸收而逐岀较外层的另一个次级光电子，此称为俄歇效应，亦称次级光电效应或无辐射效应，所逐岀的次级光电子称为俄歇电子。

它的能量是特征的，与入射辐射的能量无关。

当较外层的电子跃入内层空穴所释放的能量不在原子内被吸收，而是以辐射形式放岀，便产生X射线荧光，其能量等于两能级之间的能量差。

因此，X射线荧光的能量或波长是特征性的，与元素有一一对应的关系。

图10.1 给岀了X射线荧光和俄歇电子产生过程示意图。

K层电子被逐岀后，其空穴可以被外层中任一电子所填充，从而可产生一系列的谱线，称为K系谱线：由L层跃迁到K层辐射的X射线叫K a射线，由M层跃迁到K层辐射的X射线叫K B 射线……。

同样丄层电子被逐岀可以产生L系辐射(见图10.2)。

如果入射的X射线使某元素的K层电子激发成光电子后L层电子跃迁到K层，此时就有能量AE释放岀来，且△ E=EK-EL，这个能量是以X射线形式释放，产生的就是K a射线，同样还可以产生K B射线，L系射线等。

莫斯莱(H.G.Moseley)发现，荧光X射线的波长入与元素的原子序数Z有关，其数学关系如下：入=K(Z-s)-2这就是莫斯莱定律，式中K和S是常数，因此,只要测出荧光X射线的波长,就可以知道元素的种类，这就是荧光X射线定性分析的基当一束光或电磁波照射到物质上时，光子就与物质的分子、原子或离子等微粒相互作用而交换能量。

在通常的状态下，物质中这些微粒处于基态，吸收一定频率的辐射后，由基态跃迁到激发态，这个过程称为辐射的吸收。

处于激发态的微粒是十分不稳定的，大约过10-8—10-9秒，便以辐射的形式释放出多余的能量，重新回到基态，这个过程称为辐射的发射。

分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。

（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。

此种状态称为单线态。

• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。

若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。

则该分子所处的能级状态称为激发单线态。

• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。

若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。

2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。

3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。

4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。

5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。

由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。

在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。

处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。

激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。

若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。

如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。

现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。

每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。

分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。

根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。

若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1,该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。

大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。

基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。

处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。

处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。

辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。

(3) 荧光发射(Fluorescence emission,FE)——处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。