第四章工具酶

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4. 识别顺序
① II型限制性内切酶的识别序列非常简 单，由４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-GGATG(N)9-3’ 3’-CCTAC(N)13-5’ ；产生5’-末端突出
二、I型限制性内切酶
• 来源：E. coli B(Eco B); E. coli K12(Eco K)等。 • 同时具有内切酶和甲基化酶的活性，是一个三亚基 双功能酶。 • 辅酶：Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸 • 识别位点：15bp，非常特异
5’-TGẪNNNNNNNNTGCT-3’ 3’-ACTNNNNNNNNẪCGA-5’ N: 任一碱基；Ẫ：6-甲氨基嘌呤
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第一节
限制性内切核酸酶 Restriction Endonuclease
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限制性内切酶－基因的剪刀
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一、限制和修饰系统
• Luria, Humann等：T偶数噬菌体, Bertani, Weigle等：λ和P2噬菌体。 • 1950年代初期，他们几乎同时发现了限制 修饰现象，当时称为宿主专一性。 • 大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主 限制和修饰现象更具普遍性和代表性。
Enzyme Fnu DII Hha I Hpa II Taq I Hae II 2009-11-26 Sequence CCGG GCGC CCGG TCGA GGCC 酶切位点的数目 pBR322 ØX174 SV40 23 14 0 31 18 2 26 5 1 7 10 1 22 10 19
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C. 第三种II型限制性内切酶
• 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制 性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一 体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条 多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识 别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链； 而另一些酶识别不连续的序列(如Bcg I： CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开 DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶 的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。 他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个 域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别 特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚 基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行 使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶 将其甲基化。
Sst I Kpn I CCGC GG SacI CCGC GG Asp 718 G GTACC GGTAC C
② 识别位点相同，酶切以后的残端不同： ③ 识别位点不同，但酶切以后的残端相同，这种情 况称为同尾酶(Isocandamers)
Bam HI Bgl II Bcl I Mbo I, Sau3A
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2、特点：
①识别位点与酶切位点高度一致，具有 高度特异性。 ② 极为稳定 ③ 辅酶：Mg++
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3 限制性内切酶的命名原பைடு நூலகம்：
① 第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。 ② 第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字 母。 ③ 如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小 写，且与前3个字母紧紧排在一起。
E. coli B E. coli B
E. coli B ? E. coli K ?
Werner Arber1969年提出了限 制和修饰的概念： 宿主一方面通过一种机制限制 了噬菌体的活性；另一方面又通过 另外一种机制(修饰)改变了噬菌体的 DNA分子，使它能够在原来不能生 长的宿主细胞中存活。 2009-11-26
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①5’粘性末端
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② 3’粘性末端
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③ 平末端
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④非互补的粘性末端
酶切位点在识别顺序之外的，如：Fok I Fok I 5’-GGATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNNN-5’
Fok I 37°C
5’-GGATGNNNNNNNNN-OH 3’ 3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNN-P 5’
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6、同裂酶和同尾酶
• 来源不同的II型限制性内切酶，具有相同的识别 位点时，称为同裂酶(Isoschizomer) 。有3种情况： ① 识别位点和酶切以后的残端完全相同：
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三、II型限制性内切酶
• 是用途最广、最简单的一种限制性内 切酶。 • II型限制性内切酶的形式多样，从大 小上来说，它们可以小到如Pvu II (157个氨基酸)，也可以比1250个氨基 酸的Cje I更大。在已纯化分类的3000 种限制性内切酶中，已发现了超过 250种的特异识别序列。
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G GATCC A GATCT T GATCA N GATCN
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7、酶切位点在DNA上出现的频率
• II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现 的频率受DNA的长度、识别位点的长度以 及GC含量的影响。 • 当GC：AT＝1：1
4bp的识别位点：1/44＝256 bp 如：Hae III GGCC 6bp的识别位点：1/46＝4096 bp 如
Hind Ⅲ：Haemophilus influensae d
④ 当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒 和质粒上时，需要在名称中标出遗传成分。
Eco RI：Escherichia coli R
⑤ 若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现 顺序用罗马数字表示。
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Sac I (II)：Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
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② 识别序列一般是回文序 列 Eco RI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ③ 简并识别序列 • 有些酶的识别序列不是 一个，而是多个。 • 在基因重组时要尽量少 用这些酶
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5、酶切位点
• II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点 之中或附近，产生以下4种情况。 ①5’粘性末端；②3’粘性末端；③平末端和 ④非互补的粘性末端 • 无论DNA的来源如何，只要是使用同一种 限制性内切酶，所留下的残端都是一样的。 • 经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端 总是保留一个OH
第四章 工具酶
上海交通大学生命科学技术学院
乔中东 教授
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本节内容
• 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 • DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 • 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 • 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 • 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 • 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 • 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸 纯化、检测等。
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1、根据酶作用特点进行的分类
• 根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类： A. 最普遍的是Hha I、Hind III和Not I这样在识别 序列中进行切割的酶。有以下4种情况： a) 大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到 DNA上，因而识别的是对称序列； b) 但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别 非对称序列。 c) 一些酶识别连续的序列(如EcoR I识别GAATTC) d) 而另一些识别不连续的序列(如Bgl I识别 GCCNNNNNGGC)
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E. coli- λ噬菌体的限制修饰模式
Phage E. coli K B C λ-K 1 10-4 1 λ-B 10-4 1 1 λ-C 10-4 10-4 1
表中的数字代表相应的种植效率
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在非专一宿主细胞中噬菌体的存活率是多少？
• λ-K • λ-K • Why?
Werner Arber
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什么是限制和修饰？
• 宿主细胞通过一种叫做限制性内切酶的酶将 噬菌体的DNA切断了，从而达到限制的目 的。 • 修饰作用是通过对限制性内切酶酶切位点的 甲基化实现的。它保护了外源性DNA不被 限制性内切酶所消化。这个作用也被称为是 噬菌体对宿主细胞限制性内切酶的免疫。
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• 实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不 同，酶的识别位点的分布和频率也不同。
② 大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT 的识别序列(如Dra I：TTTAAA；Psh BI： ATTATT；Ssp I： AATTAA)较为频繁的出现； ③ 链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基 对的识别序列(Nae I：GCCGGC；Sma I： CCCGGG-；Sac II： CCGCGG)较常见。
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腺嘌呤修饰为6-甲氨基嘌呤的过程
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• DNA双链上都必须有甲基化位点才能被I型 限制性内切酶识别。如果这个序列是异源 双链的，未被甲基化的位点必须先甲基化 才能被识别。 • I型限制性内切酶具有极强的ATPase的活 性，每打开一个磷酸二脂键就需要消耗 1000个分子的ATP。 • 因酶切位点不特异，在基因工程中无意义。
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