第七章 体内药物分析法

体内药物分析体内药物分析是通过分析的手段了解药物在体内（包括实验动物等机体）数量与质量的变化，获得各种药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的方式、途径等信息。

从而有助于药物生产、实验、研究、临床等各个方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的改进和发展作出贡献。

体内药物分析任务和对象的特点：1、被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；2、样品中存在各种直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；3、样品量少，尤其是连续测定时，很难再度获得完全相同的样品；4、工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数增加；5、往往要求很快地提供结果，尤其在毒物检测工作中；6、实验室应有多种检测手段，可进行多项分析工作；7、测定数据的处理和阐明有时不太容易。

样品的种类、采集和储存一、样品的种类和选取原则：（一）血样：血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析最常采用的样本，其中选用最多的是血浆。

因血浆中的药浓可反映药物在体内（靶器管）的状况。

而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。

血浆是全血(whole blood)在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。

血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，引起析出血块，离心取得。

血块凝结时往往易造成药物吸附损失。

全血也应加入抗凝剂混匀，以防凝血。

对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆与血清麻烦，尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。

但是一些可与红血球结合或药物在血浆和血球的分配比率因不同病人而异的情况下，则宜采用全血。

血样采取量会受到一定的限制，血样取样时间间隔问题也常随测定目的不同而异。

目前大都是测定原型药物总量。

当药物与血清蛋白结合率稳定时，血药总浓度可以有效表示游离药物的浓度。

但对低蛋白症或尿毒症患者，药物结合率降低，则在通常安全有效的血药总浓度中，游离型药物浓度可显著增加。

一、A1、可作为体内药物浓度可靠指标的是A、尿药浓度B、血清药物浓度C、血浆药物浓度D、唾液药物浓度E、肌肉药物浓度【正确答案】 C【答案解析】当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度能够反映药物在靶器官的状况，因而，血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。

【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】2、在体内药物分析中最为常用的样本是A、尿液B、血液C、唾液D、脏器E、组织【正确答案】 B【答案解析】体内样品包括各种体液和组织。

但是，在体内药物分析中最为常用的样本是血液，它能够较为准确地反映药物在体内的状况。

【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】3、一般成人每天分泌唾液约A、1～2LB、1.5～2LC、2～3LD、1～1.5LE、0.5～1.5L【正确答案】 D【答案解析】一般成人每天分泌约1～1.5L。

【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】14、健康成人一日排尿量为：A、2～5LB、1～5.5LC、1～6LD、2～7LE、1～5L【正确答案】 E【答案解析】尿液包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。

健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。

【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】5、尿液的PH值：A、4.8～9.5B、4.8～8.0C、4.8～9.0D、5.0～8.0E、5.5～8.0【正确答案】 B【答案解析】健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。

【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】6、体内药物分析中去除蛋白质的方法为A、加入强酸法B、缀合物水解法C、液-液萃取法D、固相萃取法E、化学衍生化法【正确答案】 A【答案解析】去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。

其中蛋白沉淀法常用的方法包括：加入有机溶剂、强酸和无机盐。

【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】7、丙酮沉淀蛋白时，上清液pH值为2。

学科介绍基本概念体内药物浓度，尤其是血浆（或血清）药物浓度直接与药效相关，并受多种因素影响。

例如，不同给药途径（如口服、吸人、静脉注射、肌肉注射、透皮等）可直接影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响体内药物的浓度以及经时行为，并最终影响疗效。

患者的生理因素（性别、年龄等），病理状态（疾病的类型和程度），基因类型，吸收、代谢及分泌排泄功能，都影响药物在体内的经时行为。

许多药物需经肝脏代谢或经肾脏排泄，所以对于肝或肾病患者，由于他们的肝脏生物转化及代谢功能降低、或肾脏的分泌排泄功能降低，往往会造成药物在体内蓄积，进而发生药物毒性反应。

随着现代医学的不断进步，人们对医疗质量也提出了更高的要求。

治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）就是以灵敏可靠的方法，检测病人在给药后的血液或其他体液中的药物浓度，并应用药物代谢动力学理论，指导最适个体化用药方案的制定和调整，以避免用药剂量过大及可能产生的毒性反应，保证药物治疗的有效性和安全性。

学科特点体内药物分析的特点是样品成分复杂，被测组分含量低。

学科关联体内药物分析学科发展的最大推动力来自于生物医学及新药药物动力学研究领域巨大的要求和分析技术上的飞跃性进步。

与药代动力学、临床药理学和生物药剂学等学科互相关联、密不可分。

分析方法光谱分析法包括比色法(colorimetry)、紫外分光光度法（UV ）和荧光分析法（Fluor ）。

光谱法虽然仪器简单、测定快速，但选择性和灵敏度都较低，本法不具备分离功能，受结构相近的其他药物、代谢产物和内源性杂质的干扰，因此用光谱法分析体液样品时，除少数样品外，一般都需经过组分分离、纯化等预处理过程。

光谱法的灵敏度低，不适用于测定药物浓度低的生物样品。

色谱分析法包括高效液相色谱法（HPLC ）、气相色谱法（GC ）及其与质谱（Ms ）联用（HPLC 一MS , GC 一MS ）的方法，以及毛细管电泳色谱法( HPCE ）。

缀合物：缀合物类型：①葡萄糖醛酸苷：含-OH、-COOH、-NH2、–SH等功能团的成分可与葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物②硫酸酯：芳胺、酚类及醇类成分可与硫酸形成硫酸酯缀合物血浆蛋白结合率：反映了药物与血浆蛋白的亲和程度。

一般指在治疗量时药物结合的百分率，作为药代动力学的重要参数之一，影响了药物在体内的分布、代谢、排泄，与药物的药理作用强度密切相关。

一相代谢：氧化、还原、水解反应。

在药物结构中引入羟基、羧基、氨基等官能团，为二相代谢做准备二相代谢：结合反应。

具有羟基、羧基、氨基等官能团的药物与糖、硫酸盐、氨基酸等结合，极性增大，利于排肝内代谢反应类型：以氧化为主，其次为还原、水解结合肠内菌的生物转化：利用肠内菌微生物中特定酶将中药成分(或天然化合物)进行生物转化，属单酶或双酶的高密度转化。

具有高度选择性(尤其是立体选择性)和反应条件温和的特点。

以水解反应为主，其次为氧化还原反应。

·蛋白质的去除：沉淀法（有机溶剂沉淀法、盐析法、酸性试剂沉淀法、加热沉淀法）；酶消化法；超滤法、透析法、微孔滤膜过滤法。

·影响液相提取的因素：提取溶剂；水相PH值（根据待测成分PKa；为保证提取率的重现性，常使用缓冲溶液）；离子强度（越大提取率越高）·影响固相提取的因素：合适的洗涤剂和洗脱剂；流速（不宜过快）；上样量（样品突破性实验可判断上样量是否超载）·固相提取的操作步骤：固相柱选择、处理→样品上样→分离纯化→洗脱待测成分→浓缩处理或直接进样分析·检测限和定量限LOD&LOQ的确定和要求：LOQ【能从背景信号中区分出药物时所需样品中药物的最低浓度】可于空白生物基质加入定量的药物标准品混匀，配制成药浓在标准曲线末端并逐渐降低的一组药品，然后对每种浓度测定3~5次，以测定结果的精密度达到≤20％和准确度达到≤+20％时的样品中药物的最低浓度。

LOD【保证具有一定可靠性前提下，分析方法能测定出样品中药物最低浓度】-测定时记录各浓度样品每次测定得到的药物信号强度S与噪音/背景信号强度N，然后取均值S、N，以能达到S/N=3时样品药浓为LOD。

体内药物分析体内药物分析是通过分析的手段了解药物在体内（包括实验动物等机体）数量与质量的变化，获得各种药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的方式、途径等信息。

从而有助于药物生产、实验、研究、临床等各个方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的改进和发展作出贡献。

体内药物分析任务和对象的特点：1、被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；2、样品中存在各种直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；3、样品量少，尤其是连续测定时，很难再度获得完全相同的样品；4、工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数增加；5、往往要求很快地提供结果，尤其在毒物检测工作中；6、实验室应有多种检测手段，可进行多项分析工作；7、测定数据的处理和阐明有时不太容易。

样品的种类、采集和储存一、样品的种类和选取原则：（一）血样：血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析最常采用的样本，其中选用最多的是血浆。

因血浆中的药浓可反映药物在体内（靶器管）的状况。

而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。

血浆是全血(whole blood)在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。

血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，引起析出血块，离心取得。

血块凝结时往往易造成药物吸附损失。

全血也应加入抗凝剂混匀，以防凝血。

对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆与血清麻烦，尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。

但是一些可与红血球结合或药物在血浆和血球的分配比率因不同病人而异的情况下，则宜采用全血。

血样采取量会受到一定的限制，血样取样时间间隔问题也常随测定目的不同而异。

目前大都是测定原型药物总量。

当药物与血清蛋白结合率稳定时，血药总浓度可以有效表示游离药物的浓度。

但对低蛋白症或尿毒症患者，药物结合率降低，则在通常安全有效的血药总浓度中，游离型药物浓度可显著增加。

治疗药物监测（TDM）是通过测定血液或其他体液中的药物浓度，在临床药代动力学原理的指导下，使临床给药方案个体化，以提高疗效、避免或减少毒副反应应用:1）药物有效血药浓度范围狭窄——代表药物地高辛、奎尼丁等2）药物剂量小、毒性大——代表性药物有利多卡因、地高辛等3）药物体内过程个体差异大，具有非线性药代动力学特性——代表性药物有苯妥英钠、茶碱、水杨酸等4）处于某些病理状况（如胃肠道、肝脏、肾脏疾病），应用上述药物治疗时5）合并用药有相互作用而影响疗效或有中毒危险时6）某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时——代表性药物如地高辛、速尿等7）长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性；或诱导和抑制肝药酶的活性；以及原因不明的药效变化时8）常规剂量下出现严重毒性反应时；诊断和处理药物过量中毒；为药物引起的医疗事故提供法律依据时药物非临床药代动力学研究受试动物1首选动物：尽可能与药效学和毒理学研究一致。

2尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。

3创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。

其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或猴等）。

4口服用药不宜选用兔等食草类动物。

5受试动物数：以药时曲线的每个时间点有不少于5个数据为限计算所需动物数。

最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。

多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。

建议受试动物采用雌雄各半，如发现药动学存在明显的性别差异，应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。

对于单一性别用药，可选择与临床用药一致的性别。

药代动力学研究采样点的确定1采样点的确定：采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的血药浓度-时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异，由此计算的药代动力学参数也就失去了意义。

一、名解：1、体内药物分析（Biopharmaceutical analysis）:【狭义】利用现代分析仪器和分离手段对人和动物的血液、尿、组织等样品进行定性定量的分析。

【广义】通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产，临床应用作出评价。

2、散射光：光通过物质时，有小部分在侧向散射开来，这种现象叫做光的散射，若散射光的频率与入射光的频率相同，则称为溶剂的瑞利散射光。

3、拉曼光：若散射光的频率与入射光的频率不同，则称为溶剂的拉曼光。

4、紫外双波长分光光度法：吸收光谱重叠的a、b两组混合物中，从b的吸收光谱上选择两个吸收度相等的波长λ1和λ2，测定混合物在两个波长处吸收度的差值，即可消除b的干扰以测定a，这种方法叫做双波长分光光度法。

5、高效液相色谱（HPLC）：以经典液相色谱为基础，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器并引入气相色谱理论而发展起来的分离技术。

6、微径液相色谱法：是采用高效毛细管柱的液相色谱法，即采用细管细粒度、短柱子实现高效快速的分离。

7、抗原：凡能刺激机体产生免疫反应的物质称为抗原。

8、半抗原：只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。

9、人工抗原：药物本身不具有免疫原性，只有当他们与某些大分子载体物质结合后所形成的全抗原。

人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。

10、标准抗原：指在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品。

11、特异抗体（Specific Antibody）：指抗原（免疫原）作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白（lgG约占70%）。

二、体内药物分析与其他学科的关系（一）药物动力学及生物药剂学定量测量药物浓度可：1、求出动力学参数和药物制剂的生物利用度参数；2、评价药物与制剂的内在质量；3、确保临床用药的安全性和有效性。

（二）与临床药理学的关系临床药理学的研究内容：1、研究药物进入人体内对人体生理与生化机能影响和临床效应，以及药物的作用原理。

第一部分概述体内药物分析是对体内样本（包括生物体液、器官或组织）中的药物、代谢物或内源性物质的定量分析。

体内药物分析是药代动力学研究和治疗药物监测（TDM）的重要手段。

药物在临床前研究阶段，首先在试验动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究；在临床研究阶段，要对药物作用于人体的安全性与有效性作出评价。

这些研究中，建立有效的体内药物分析方法是首要任务。

随着现代医学的不断进步，精准医疗和个体化治疗成为新的理念。

TDM 就是采用灵敏可靠的方法，检测患者体内的药物浓度，指导个体化用药方案的制定，保证用药的有效性与安全性。

另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有重要意义；对于麻醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成。

药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位，因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。

另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。

药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要；机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关。

所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物活性物质也是体内药物分析的目标。

在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件。

体内样品大都具有以下性质特点：①采样量少，采样量一般为数毫升至数十微升，且在特定条件下采集，不易重新获得。

②待测物浓度低，通常在10-9~10-6g/ml级，甚至低至10-12g/ml。

③干扰物质多，血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物和Na+、K+等大量内源性物质通常对测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合，也能干扰测定。

体内药物分析药学体内药物分析分析方法建立后需进行包括准确度、精密度等一系列的评价项目进行验证，请问：对所建立的药物的体外及体内分析方法，其验证要求有何不同，为什么？试举两例文献说明。

药物的分析方法均需验证：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、专属性、线性、范围、耐用性药物分析是测定原料药、制剂及有关杂质的含量，控制药物生产至临床应用前药物的质量；体内药物分析则是药物体内研究和临床用药期间测定生物样品中药物的含量。

由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素，因此体内药分比药物分析在灵敏度和专属性上的要求更高，自然两者的方法验证要求也不同。

药物分析方法的验证1、准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。

2、精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。

（1）重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

（3）重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

3、检测限（limit of detection，LOD）检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。

4、定量限（1imit of quantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。

5、专属性（specificity ）（选择性）：指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。