转染步骤111

细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。

当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系:(6cm盘)2。

4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。

3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。

4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。

5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。

6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。

7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。

8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。

2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。

9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。

10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.所需物品:1。

转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。

24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6。

G418 7. 1mlHEPES液。

细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。

这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。

在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。

下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。

第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。

其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。

RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。

第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。

要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。

常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。

第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。

制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。

转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。

接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。

转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。

第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。

这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。

2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。

3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。

4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。

以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。

在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。

细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。

常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。

其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。

二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。

2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。

3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。

4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。

5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。

三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。

2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。

3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。

4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。

5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。

若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。

四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。

2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。

3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。

4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。

5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。

五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。

实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。

细胞转染的详细过程细胞转染的详细过程1、准备工作如下：1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。

细胞培养在适合的培养基中。

细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。

用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。

2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。

3)细胞在27℃孵育至少一小时。

4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合：用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。

用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。

将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。

5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml 无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。

6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。

7)细胞在27℃孵育5小时。

8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。

9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。

2、第一代代病毒的收集与保存1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。

2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。

3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.二、转染操作流程（以常用地孔板为例）()细胞培养：取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).()转染液制备：在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.三、转染注意事项. 血清. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多..抗生素（）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量..细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售..细胞铺板密度用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，.启动子地选择获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.量高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高..瞬时和稳定表达及监测转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法..稳定转染细胞系地筛选连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数..蛋白表达和培养基地选择哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.。

转染步骤及经验（精华）转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。

其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。

影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。

二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）（1）细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37C 5%CO2培养箱中培养至70%?90%汇合。

（不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞）。

（2）转染液制备：在EP管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量） A液：用不含血清培养基稀释1-10卩g DNA终量100 yL, B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100 uL轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL 不含血清及PS的培养液。

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37C温箱置6?8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

三、转染注意事项1.血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。

B?一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。

一般转染操作步骤
1、稀释转染试剂
将6ul转染试剂FuGENE加到装有90-98ul预热到室温培养基的无菌聚丙乙烯管中，立即混匀，室温放置5min。

注：勿将未稀释的转染试剂FuGENE碰到管壁，造成稀释不充分。

2、制备转染物
加2ug的质粒DNA至稀释的转染试剂中，立即混匀，室温放置15min。

注：勿超过45min，否则影响转染效率。

3、添加转染物至细胞培养液
将2-10ul的转染物加到含有100ul细胞培养液的96孔板中，轻轻吸打或者左右摇晃10-30S以充分混匀。

推荐：5ul作为起始点
4、孵育培养
置于CO2培养箱中，培养24-48h检测。

转染试剂FuGENE：DNA=3:1
质粒DNA浓度：0.2-1 ug/ul
96孔板每孔2-10ul转染物成分：0.15-0.6ul的转染试剂+0.04-0.2ug的质粒DNA。

基因转染技术简介常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。

转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。

如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。

对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。

用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。

具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE 葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。

靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。

根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。

如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。

转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

以下是转染步骤的详细描述。

第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。

细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。

第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。

化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。

病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。

质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。

第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。

转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。

第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。

常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。

通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。

除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。

同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。

总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。

细胞DNA转染实验步骤（entranster）
下面以Entranster-H4000，DNA转染试剂为例，简要说明DNA 细胞转染实验步骤
1.提前一天细胞铺板
提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。

2.转染过程
⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵将2μl的EntransterTM-H4000用25μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，制成EntransterTM-H4000稀释液。

室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-H4000稀释液分别加入到DNA稀释液中，充分混匀（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。

注意：①对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

②完全培养基可加抗生素。

⑸培养4-6小时后更换培养基，继续培养24-48小时。

注意：①如细胞没有毒性等不良情况，转染后4-6小时可不必更换培养基。

重要提示
1.本品在转染过程中可以添加抗生素，抗生素的添加与否不影响转染效率和毒性。

2.如转染后需要用Trizol提取RNA，建议转染后6小时换液。