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克隆技术在植物保护中的应用随着科技的不断进步，克隆技术逐渐成为了植物保护领域中的重要手段。
克隆技术通过复制优良基因，提高植物品质和抗病能力，为植物保护提供了全新的解决方案。
本文将从克隆技术在无性繁殖、基因提取以及疫情防控等方面进行探讨。
一、克隆技术在植物无性繁殖中的应用无性繁殖是指通过植物器官的分裂、分化，形成新个体，而不需要雌雄交配的过程。
在传统繁殖方法中，种植者需要依赖于种子繁殖植物。
然而，种子繁殖存在着遗传变异的问题，种植者无法保证下一代的质量和稳定性。
克隆技术通过植物组织培养、植株分割等手段，实现了无性繁殖的高效快速。
例如，通过离体培养可以将植物应用于组织工程和育种项目中，提高植物的生长速度和产量，从而实现植物无性繁殖的优化和控制。
二、克隆技术在植物基因提取中的应用植物基因提取是研究植物基因组和遗传变异的重要手段。
克隆技术可以通过复制植物细胞、组织或器官中的特定基因，帮助研究人员准确提取并分析植物的遗传信息。
通过克隆技术，研究人员可以得到大量无差异的基因材料，为植物基因组学研究提供了重要的工具。
此外，克隆技术还可以帮助研究人员实现对植物基因的修改和改良，为研究植物的遗传特性和育种提供了新的可能性。
三、克隆技术在植物疫情防控中的应用植物在生长和发育过程中，容易受到各种病毒、细菌和真菌的侵袭，导致疾病的发生和传播。
疫情的防控一直是植物保护工作者的重点关注。
克隆技术在植物疫情防控中有着重要的应用价值。
通过克隆技术，研究人员可以复制和繁殖具有抗病特性的植物，提高植物的抗病能力。
此外，克隆技术还可以用于培育病毒抗性的基因型，有效防止病毒在植物中的传播。
通过克隆技术在植物疫情防控中的应用，可以减少植物疾病对农作物生产的损害，提高农业生产的质量和效益。
综上所述，克隆技术在植物保护中的应用为植物繁殖、基因提取以及疫情防控等方面提供了新的解决方案。
通过克隆技术，可以提高植物的遗传质量、抗病能力以及农作物的产量和质量。
基因克隆技术是19世纪70年代初开始发展起来的一项研究技术。
它是研究某一特定基因的表达和功能研究的第一步。
基因克隆技术的发展为作物研究提供了新的技术方法和研究方向。
研究人员利用作物基因克隆技术，通过改变基因型实现了农作物产量、品质、抗性等多种性状的改良，显著提高了农作物的质量。
随着基因克隆技术的不断发展并投入实践应用，关于基因克隆的技术研究也在不断改进。
目前几乎作物研究的每个领域，都有基因克隆技术的身影。
作物基因的克隆技术是作物育种研究的重要组成部分。
主要内容是鉴别分离突变体特异基因并得到完整的基因序列种，进行基因定位，筛选有利性状，最后应用到作物生产实践中。
作物基因克隆技术通常分为两种。
相对比较传统的研究途径的是正向遗传学方式。
反向遗传学途径是新型研究方法，它是先获得遗传基因片段，反向研究基因。
本文主要从几种基因克隆技术的角度出发，来介绍作物基因克隆技术的研究进展，并展望了作物基因克隆技术的发展前景。
1.常用传统基因克隆技术1.1功能克隆功能克隆是出现最早的基因克隆技术之一。
它主要通过研究表达的异常蛋白质，在已知遗传损伤所引起的蛋白质缺陷信息的情况下，进行基因定位并克隆。
步骤的关键是先已知蛋白质，再将其的mRNA反转录成cRNA，然后作为探针，从而从基因组中克隆到所需基因。
更有趣的是，当获得某一个植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守时，也可以通过利用这些已知基因片段，去筛选未知基因库，从而分离出未知新基因。
周兆斓等利用Kond等克隆和测序编码了水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组，之后将其导入甘薯、马铃薯、茄子等多个作物，极大地改善了作物的抗虫能力。
功能克隆是人们在克隆领域摸索出第一种最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。
功能克隆是简单实用的方法，但是它需要已知基因信息才能进行克隆，因此最初应用功能克隆方法的时候，具有很大的局限性。
1.2定位克隆定位克隆又叫图位克隆，是人们研究出的可以克服基因编码序列未知对功能克隆限制性的一种克隆方法。
克隆技术的新进展克隆技术，作为生物科技领域中备受关注的话题，一直以来都备受质疑。
尽管克隆技术的发展成果丰硕，然而这项技术的局限性与伦理道德问题一直是被广泛关注的话题。
但是，随着科技的不断进步，克隆技术迎来了一些新的突破和进展，在生物科技领域中渐渐发挥出重要的作用。
本文将从三个方面，分别是动物基因编辑技术、植物克隆技术和人类克隆技术，来看看克隆技术在这些方面中的新进展。
动物基因编辑技术动物基因编辑技术是当前克隆技术领域中最具潜力的方向之一。
最近几年，基因编辑技术被广泛应用于动物克隆研究中。
科学家们利用基因编辑技术，遗传密码子的修改、蛋白质的修饰、基因表达的调节等方面进行了额外的实验研究。
最近牛克隆技术的进展，利用了质粒注入和Crispr-Cas9 这两种技术，实现了牛克隆基因编辑。
它们的设计方程式 C = A + B - D，改变了物种性状和性能，从而实现了育种的目标。
植物克隆技术植物克隆技术被广泛用于农业生产领域中。
植物克隆技术是通过细胞培养技术和组织培养技术，在培养环境中发出足够的细胞、组织团块，以及最终形成植株。
最近几年，植物品种改良成果丰硕，目前，植物克隆技术已经应用于食品安全，植物智能化种植和污染环境修复等方面。
例如，某些设施农场中，植物克隆技术被用来扩大某些植物品种的繁殖率，从而保证了其生产效率和订单状况。
此外，在环境修复领域中，植物克隆技术还用于优化植物的自净作用，以降低污染物质的水平。
人类克隆技术虽然人类克隆技术一直备受争议，但是其对于解决某些医学难题具有重要的意义。
技术的进步使得药物研究更为准确和有效，此外，与生殖相关的难以治愈的疾病也有可能得到有效的治疗。
例如，最近在亚洲的某些项目中，科学家成功地将人类胚胎的基因进行了编辑，使得基因突变相关的疾病治疗的前景更为美好。
同时，基因编辑技术也将有可能成为人类克隆技术研究的重要手段之一，因为基因改造可以很好地解决一些遗传难题。
总结总的来说，尽管克隆技术在实践过程中遇到了不同的困难，但是新的进展代表了这项科技的前景和未来发展的可能性。
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
基因工程在植物育种中的应用官玲(GUAN Ling)(莆田学院环境与生命科学系福建莆田351100)摘要：在现代生物技术中，基因工程作为一个重要的部分，已经在生产和生活等多方面起着重要的作用。
不断成熟的基因工程技术它解决了传统育种不能突破的问题，与传统育种方法相比, 基因工程技术具有独特优势可以定向修饰植物的某些目标性状并保留其它原有性状通过引入外来基因扩大基因库。
本文主要综述了基因工程在药用植物和花卉植物育种中的研究状况及对以后的发展现状进行的展望。
关键词：基因工程;植物育种;基因芯片技术;前景展望基因工程是指运用分子生物学技术, 将目的基因或DNA片段通过载体或直接导入受体细胞, 使受体细胞遗传物质重新组合, 经细胞复制增殖, 新的基因在受体细胞中表达, 最后从转化细胞中筛选有价值的新类型, 继而它再生为工程植株, 从而创造新品种的一种定向育种技术。
与传统育种相比, 植物基因工程具有以下特点植物基因工程是在基因水平上来改造植物的遗传物质, 更具有科学性和精确性,同时育种速度也大大加快能定向改造植物的遗传性状, 提高了育种的目的性与可操作性植物基因工程大大地扩展了育种的范围, 打破了物种之间的生殖隔离障碍, 实现了基因在生物界的共用性, 丰富了基因资源及植物品种。
1.基因工程技术在药用植物育种中的应用由于医药事业的快速发展, 野生药材资源已远远不能满足需要, 尤其是许多原料性药用植物资源已面临资源枯竭的威胁, 加之人工驯化和栽培的药用植物物种退化和濒危的问题极为突出。
根据这些中药资源的活性成分、生长规律、生产特性, 运用生物工程技术对其进行保存性研究, 从而保护濒危紧缺的药用植物资源.。
通过遗传转化, 将目的基因（如抗逆、抗病毒、抗虫、抗除草剂等相关基因）导入药用植物以改变传统遗传性状, 培育优良品种, 增强药用植物抗病毒、抗虫害、抗除草剂的能力, 利用植物生产异源蛋白及改变植物质量性状、保护和繁殖濒临灭绝的植物材料[1].1.1优良品种的培育刘建勋等[2]利用PCR 技术克隆出青蒿素生物合成途径中的关键酶基因和东北红豆杉中紫三醇生物合成途径中起限速作用的紫三烯合成酶基因, 该基因cDNA 片段由2586 个核苷酸组成, 将该cDNA 片段导入红豆杉细胞后, 影响紫杉醇含量。
植物遗传育种中的新技术与新成果近年来，随着人们对食品安全、环境保护和资源利用的关注不断增强，植物遗传育种技术也在不断发展与完善。
本文将围绕植物遗传育种的新技术和新成果展开阐述，并分为基因编辑、基因组学和遗传多样性保护三个方面进行讨论。
一、基因编辑技术随着基因编辑技术的不断发展，CRISPR-Cas9系统已经成为植物遗传育种领域中最受关注的技术之一。
CRISPR-Cas9系统是一种基于RNA导向的基因编辑工具，能够精确地剪切DNA链，进而实现特定基因的敲入、敲出或修饰。
在植物领域，CRISPR-Cas9系统已成功用于多个作物的遗传改良，例如水稻、玉米、小麦、大豆等。
以水稻为例，研究人员利用CRISPR-Cas9系统对水稻品种中的籼性和粳性相关基因进行编辑，取得了显著产量和品质的改善。
此外，CRISPR-Cas9系统还可以用于植物的抗病和耐逆性的增强。
例如，研究人员利用该技术成功地提高了棉花和拟南芥的盐碱逆境耐受性。
二、基因组学技术随着物种基因组信息的不断完善，基因组学技术在植物遗传育种中的应用也越来越广泛。
基因组学技术可以帮助人们更好地了解植物的遗传特性和进化历史，为植物的育种工作提供更为准确的基础数据和指导。
例如，在玉米遗传育种中，研究人员运用基因组学技术对不同玉米种质进行了全基因组测序，发现了多个与玉米农艺特性相关的基因，为玉米的改良提供了基础信息。
同样，基因组学技术也被广泛应用于蔬菜和水果的遗传育种中。
例如，利用基因组学技术，研究人员成功地发掘了草莓中的多个与果实颜色和香气有关的基因，为草莓的品质改进打下了基础。
三、遗传多样性保护遗传多样性保护一直是植物遗传育种的重要内容之一。
随着人口的增长和农业生产的加强，自然遗传资源的消失和减少越来越引起人们的关注，因此保护和利用遗传多样性的工作越来越受到重视。
为了保护和利用植物的遗传多样性，研究人员开发了多种技术，包括种质资源收集、保存和利用技术、遗传多样性评价技术、基因库建设与管理技术等。
如何通过基因工程技术改造植物抗虫性与抗病性植物是人类生活的重要资源，而植物病虫害是限制农作物产量和质量的主要因素之一。
为了解决这个问题，科学家们通过基因工程技术改造植物，使其获得更强的抗虫性与抗病性，以提高农作物产量和质量。
本文将介绍如何通过基因工程技术改造植物的抗虫性与抗病性，并讨论其中的挑战和前景。
一、基因工程技术的基本原理基因工程技术是一种通过改变生物体的基因组成来获得特定特征的方法。
它主要包括三个步骤：基因的克隆、转化和表达。
首先，科学家们通过克隆技术，将具有特定特征的基因从一个生物体中提取出来。
然后，他们通过转化技术将这些基因导入到目标植物细胞中。
最后，这些基因在植物细胞中得到表达，从而使植物获得特定的性状。
二、改造植物的抗虫性虫害是农作物生产中常见的问题，对农作物产生了巨大的损失。
为了解决这个问题，科学家们通过基因工程技术改造植物的抗虫性，以减少虫害对植物的危害。
1. 插入抗虫基因科学家们通过插入抗虫基因来提高植物的抗虫性。
这些抗虫基因可以是来自其他生物的毒素基因。
例如，一种常用的抗虫基因是来自嗜盐细菌的Bt（Bacillus thuringiensis）基因。
Bt基因编码产生的蛋白质具有杀虫活性，在植物体内能够杀死害虫。
将Bt基因导入植物细胞后，植物就会产生该杀虫蛋白质，从而获得抗虫性。
2. 增强植物的防御系统除了插入抗虫基因外，科学家们还可以通过增强植物的防御系统来提高其抗虫性。
植物的防御系统包括识别害虫入侵、产生化学物质以抵御害虫、吸引天敌等机制。
通过基因工程技术，科学家们可以增强植物的防御系统，使其更加有效地对抗害虫的入侵。
例如，增加植物产生抗虫化合物的能力，或者增加植物诱释化学物质吸引天敌等。
三、改造植物的抗病性与虫害相似，植物病害也给农作物生产带来了极大的挑战。
通过基因工程技术改造植物的抗病性，可以降低病害对农作物的危害。
1. 插入抗病基因科学家们通过插入抗病基因来提高植物的抗病性。
植物遗传育种研究的最新进展随着人类对自然的探索不断加深，对于植物遗传育种研究的兴趣也越来越浓厚。
过去几十年中，科技的飞速发展推动了植物遗传育种研究的进一步深入，许多新的技术和理论被提出和应用。
本文将介绍植物遗传育种研究的最新进展，并探讨其对人类和环境的影响。
遗传学基础要谈植物遗传育种，我们首先需要了解遗传学的基本概念。
简单来说，基因是决定个体性状的小分子，它们以一定的方式组装成一个个染色体。
孟德尔发现了显性和隐性遗传的现象，而克隆羊多利则引爆了基因工程的风暴。
这些重大的发现为遗传学的发展奠定了基础，也为植物遗传育种的研究提供了先决条件。
基因编辑技术一个人的身体，就像一株植物。
它们都有自己的基因组成，而科学家们正利用这些知识来研究和改良植物。
近年来，基因编辑技术的发展给植物育种工作带来了更大的进步空间。
基因编辑利用了CRISPR技术，能够准确地将某个基因的序列删除或修改。
这样，育种者可以通过更改植物的DNA序列来实现速度更快、更高效的育种，例如强制植物具有对臭氧和盐的耐受力等特殊属性。
遗传多样性保护由于人口增长和生物多样性下降的压力，保护和维护植物基因多样性已经成为一个重要议题。
为解决这个问题，各国将遗传多样性保护作为保护自然生态系统和文化遗产的核心任务之一。
遗传多样性的保护工作需要合理利用现有资源在植物遗传多样性、栖息地、基因库等方面开展科学研究，利用生态环境来维护和促进植物遗传育种的多样性。
科学家们正在研究如何将多样性理念融入到遗传育种和生产植物量的培育过程之中。
重点研究物种随着人们日益对优质和高产量植物的需求增加，往往是对极少数物种进行重点研究。
这些物种医学上也很重要，如小麦、玉米、大豆等农产品，也如人参、秦艽等传统中药材。
由于其重要性，科学家们在各种育种方法上进行了深入研究。
例如，在小麦、玉米和大豆中，通过DNA技术的高清图像阅读来实现基因编辑，其中的一些方法使植物生长得更快，更抵抗病原体，更能适应不利环境。
作者简介梁锦锋（１９７６－），男，浙江临海人，在读博士，讲师，从事植物药物化学和分子生物学研究。
收稿日期２００７!０４!０２２０世纪７０年代，基因工程的出现使人们在分子水平上对目的基因进行克隆成为可能，并引起了研究者广泛的兴趣。
至今，各种植物抗性基因以及提高植物品质的相关基因克隆已取得较好结果并部分商品化，涉及植物发育遗传调控与信号转导如导致合子形成和胚胎发育、调控花粉管生长、控制叶片发育和根发育、营养细胞和生殖器官细胞分化等相关基因的克隆也取得巨大进展。
模式植物结构基因组的相继阐明，多种植物高密度分子标记连锁图谱的构建、大片段ＤＮＡ克隆系统的建立，序列测定技术和基因遗传转化技术的发展，使得更多未知基因的克隆成为可能。
随着ｇｅｎｅｂａｎｋ中数据的急剧增加，分子操作技术的日渐完备以及研究基因差异性表达的重大意义，表达序列标签技术、同源序列技术、图位克隆和差异表达基因分离等技术将越来越受重视。
为此，笔者对植物新克隆策略和技术发展进行了综述。
１基于表达序列标签（ＥＳＴ）的基因克隆ＥＳＴ是一段长约１５０￣５００ｂｐ的基因表达的外元序列片段，是完整基因上能特异性标记基因的一段序列，通常包含了基因足够的结构信息区。
随着基因组作图技术和大规模测序技术的发展和日渐成熟，植物基因组研究，如遗传图谱、物理图谱、全基因组测序以及功能基因组学等将全面展开，通过数据库查询、ｃＤＮＡ文库直接测序、ｍＲＮＡ差别显示（ＤＤＲＴ!ＰＣＲ）、代表性差示分析（ＲＤＡ）和抑制差减杂交（ＳＳＨ）等方法获得的ＥＳＴ数据也必将呈加速度增长。
因此，在现代基因工程研究中如何借用现代生物信息学手段充分利用ＥＳＴ克隆新基因也越来越为重要。
１９９１年，美国国立卫生研究院生物学家Ｖｅｎｔｅｒ首先提出了发现表达基因的新战略，即用表达序列标签（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ，ＥＳＴ）克隆和定位新基因。
这一构想的具体过程是将ｍＲＮＡ在体外反转录成ｃＤＮＡ后克隆到载体上，构建ｃＤＮＡ文库，再从ｃＤＮＡ文库中大规模随机挑选ｃＤＮＡ克隆，对其３′端或５′端进行一步法测序获得ＥＳＴ。
利用ＥＳＴ克隆基因和分析基因表达使得克隆和定位新基因的策略发生了革命性的变革。
近年来，三大国际一级生物信息数据库ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ新收录的核酸序列数据中，ＥＳＴ占６５％以上。
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中收录的ＥＳＴ序列有数百万个之多，如拟南芥的ＥＳＴ有１０万余个，水稻有４万余个，玉米有７万余个。
我国也计划在未来的几年中获得水稻的ＥＳＴ１０万个。
由于ＥＳＴ代表着一段表达基因序列，这就可用ＥＳＴ或多个ＥＳＴ序列组装的基序与公共数据库的基因进行“电子杂交”，进而可以从理论上推测其所代表的基因的功能。
经电子杂交基因筛选后的ＥＳＴ及其延伸基序可作为某一基因标签，结合ＰＣＲ技术克隆新基因，其过程如下：首先以该标签序列提供的信息设计合成基因特异引物（ＧＳＰ），再用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）对ｍＲＮＡ进行反转录的同时加上锚定引物，然后在总ＲＮＡ中，采用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）技术，获得目的基因的全长序列；或者是用该标签序列提供的信息设计引物，合成探针对ｃＤＮＡ文库进行筛选，挑取最长的阳性克隆进行测序，以期获目的基因。
基于ＥＳＴ电子杂交的基因克隆为预测基因序列和功能提供了经济快捷的手段和大量信息，但由于ｍＲＮＡ在不同时空的丰度差异、反转录酶的误配、同功密码子的存在、物种间的特异性、电子杂交对错误碱基的敏感性等，常造成预测的精度较低。
因此，在序列分析时应用多种综合软件如ＧｅｎｅＳｃａｎ、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ等相结合，使候选序列同见于２个或２个以上的文库，以有效排除假阳性结果。
２基于同源序列的候选基因法这是一种克隆基因的新策略。
根据基因家族保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物对含目的基因的ＤＮＡ文库进行扩增，再对扩增产物进行扩增、克隆和鉴定。
如通过对已克隆的抗性基因蛋白序列的分析，发现这些抗病基因所编码的蛋白都存在同源序列，如富含亮氨酸重复区（ＬＲＲ）、核苷酸结合位点（ＮＢＳ）、蛋白激酶（ＰＫ）等，所以人们设想用同源序列来克隆新的抗病基因。
王石平等根据这些保守序列设计合成了特异性和兼并性引物，对水稻基因组ＤＮＡ进行扩增，得到了１００个大小不同的克隆，定位了２６个克隆，其中的１０个克隆与８个已定位的水稻抗病基因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻，这表明这些克隆的抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系，证明了同源序列分离和克隆基因的可能性。
黄烈健等根据已克隆的抗病基因同源序列设计引物，对玉米ＤＮＡ进行扩增、克隆并对克隆进行测序，测序结果表明与Ｇｅｎｂａｎｋ进行序列同源性比较，二者达８５％以上。
该法的长处在于：若同源序列与抗病基因紧密连锁或带有抗性基因的同源序列，则可用其作探针来筛选基因组文库，获得侯选基因，但植物基因组中有许多与ＬＲＲ或ＮＢＳ同源的区域，其功能并不都是与抗病有关，所以，该技术应与图位克隆技术结合使用。
同源序列技术存在的问题也是值得重视和思考的：①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物植物新基因克隆策略和技术进展梁锦锋１，于红卫２，叶国平３（１．浙江林学院林业与生物技术学院，浙江临安３１１３００；２．浙江林学院工程学院，浙江临安３１１３００；３．浙江省临海市林特局，浙江临海３１７０３６）摘要对基于表达序列标签（ＥＳＴ）的基因克隆、基于同源序列的候选基因法、基因图位克隆、基因转座子标签技术和差异表达基因分离技术等植物新基因克隆策略和技术进行了总结，并对其优缺点进行了简要介绍。
关键词基因克隆；表达序列标签；同源序列；图位克隆；转座子中图分类号Ｑ７８文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００７）２３－０７１１２－０３安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（２３）：７１１２－７１１４责任编辑姜丽责任校对王淼的特异性要设计得当；②由于某些同源序列并不专属于某一家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族的成员；③基因家族成员成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。
因此，对ＰＣＲ扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析、插入失活或遗传转化等功能鉴定，以便最终筛选到目的基因。
３图位克隆技术是近几年随着各种植物分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种基因克隆技术，是根据功能基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（如ＢＡＣ和ＹＡＣ），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段克隆作探针筛选ｃＤＮＡ文库；从而将目标基因确定在一个较小的ＤＮＡ片段上并进行序列分析，通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定获得目的基因。
Ｇｉｒａｕｄａｔ等成功地克隆了与拟南芥种子形成和发芽有关的脱落酸信号传导基因ＡＢＩ３；Ａｒｏｎｄｅｌ等则克隆到拟南芥脂肪酸脱饱和基因酶基因ＦＡＤ３；利用图位克隆技术克隆到的抗病基因主要有番茄Ｐｔｏ、拟南芥ＲＰＳ２、ＲＰＭ１和ＮＰＲ１以及水稻Ｘａ２１和Ｐｉ#ｂ基因。
图位克隆技术依赖于高密度的分子标记图谱，而随着许多高密度的遗传图谱不断获得，实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记，寻找与目标基因连锁的分子标记的方法主要有２种：一是利用近等基因系，即通过检测近等基因系间分子标记多态性来确定目标基因与分子标记的遗传连锁关系；二是利用分离群体分组分析法（ｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ），对于尚没有分子连锁图谱或虽有图谱但连锁密度不高的植物，以及分离没有近等基因系的目的基因，适合应用这种方法。
４转座子标签技术转座子是ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ首先在玉米中发现的，之后在金鱼草、飞燕草、甜豌豆、细菌、酵母、拟南芥和一些多细胞绿藻等植物中也发现了转座子的存在。
２０世纪８０年代中期人们在了解转座子的遗传特性和分子结构的基础上，开始用转座因子作为分子标签来分离由于它的插入而引起突变的基因，在植物中利用的转座子有Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ和Ｍｕｔａｔｏｒ，其中应用最多的是Ａｃ／Ｄｓ双因子系统。
由转座子引起的突变可以转座子ＤＮＡ为探针，从纯合突变株构建的基因组文库中筛选含该转座子的同源片段，并获得含有部分突变株ＤＮＡ序列的克隆，进而以该ＤＮＡ为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。
Ｊｏｈａｌ等利用转座子克隆到玉米抗圆斑病基因ＨＭ１，这是第一个克隆的功能产物未知的植物抗病基因；Ｊｏｎｅｓ等利用Ａｃ／Ｄｓ系统克隆到番茄抗叶霉病基因ｃｆ２９；Ａａｒｔｓ等利用Ｅｎ／Ｓｐｍ克隆到拟南芥菜的一个雄性不育基因；Ｃｕｉ等利用Ｍｕｔａｔｏｒ克隆到了玉米胞质一个恢复基因。
利用转座子标记技术，目前已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圆斑病基因Ｈｍ１、Ｈｍ２，番茄抗叶霉病基因Ｃｆ#２，Ｃｆ#４，Ｃｆ#５．Ｃｆ#９及Ｃｆ#ＥＣＰ２，烟草抗花叶病毒病基因Ｎ，亚麻抗锈病基因Ｌ６，Ｍ。
这些均表明该技术是目前分离克隆抗病基因的有效工具之一。
该技术的优点在于：①分离基因不需要预先知道被标签产物的结构、性质，因此那些背景尚不清楚的如发育、抗病及与生理过程有关的基因都有可能用该法来分离；②转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复；③由于转座子总是沿其邻近的位点转座，因此只要转座子在染色体上定位后，就很容易确定与其连锁的突变基因的相对位置；④如果把转座子导入目标植物，通过自交、杂交、回交等方法便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体；⑤把转座子导入异源植物不受转化条件的限制。
但转座子标签技术的推广还存在一些困难，如筛选鉴定转座元件引起的表型突变体都是在个体水平上进行的，因而工作量非常大；而且，定向标签还要求有隐性纯合体可进行杂交；由于一些植物很难获得转座子突变体，因而不能运用该方法；对于基因组庞大、重复序列多的植物，该技术的应用也受到了限制。
５差异表达基因分离技术５．１扣除杂交技术扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取ｍＲＮＡ经逆转录形成ｃＤＮＡ探针，与无特异性表达基因的参照样的过量ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ杂交，经２轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ，将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标ｃＤＮＡ纯化富集、扩增，建立相应ｃＤＮＡ文库即为差异表达基因ｃＤＮＡ文库。
该技术最早是由Ｌａｍａｒ和Ｐａｌｍｅｒ于１９８４年提出的，经过多年的改进，它已发展成为众多克隆技术的基础，很多克隆技术都是从该技术衍生而来的，如抑制性扣除杂交技术。
