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基因克隆技术是19世纪70年代初开始发展起来的一项研究技术。
它是研究某一特定基因的表达和功能研究的第一步。
基因克隆技术的发展为作物研究提供了新的技术方法和研究方向。
研究人员利用作物基因克隆技术，通过改变基因型实现了农作物产量、品质、抗性等多种性状的改良，显著提高了农作物的质量。
随着基因克隆技术的不断发展并投入实践应用，关于基因克隆的技术研究也在不断改进。
目前几乎作物研究的每个领域，都有基因克隆技术的身影。
作物基因的克隆技术是作物育种研究的重要组成部分。
主要内容是鉴别分离突变体特异基因并得到完整的基因序列种，进行基因定位，筛选有利性状，最后应用到作物生产实践中。
作物基因克隆技术通常分为两种。
相对比较传统的研究途径的是正向遗传学方式。
反向遗传学途径是新型研究方法，它是先获得遗传基因片段，反向研究基因。
本文主要从几种基因克隆技术的角度出发，来介绍作物基因克隆技术的研究进展，并展望了作物基因克隆技术的发展前景。
1.常用传统基因克隆技术1.1功能克隆功能克隆是出现最早的基因克隆技术之一。
它主要通过研究表达的异常蛋白质，在已知遗传损伤所引起的蛋白质缺陷信息的情况下，进行基因定位并克隆。
步骤的关键是先已知蛋白质，再将其的mRNA反转录成cRNA，然后作为探针，从而从基因组中克隆到所需基因。
更有趣的是，当获得某一个植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守时，也可以通过利用这些已知基因片段，去筛选未知基因库，从而分离出未知新基因。
周兆斓等利用Kond等克隆和测序编码了水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组，之后将其导入甘薯、马铃薯、茄子等多个作物，极大地改善了作物的抗虫能力。
功能克隆是人们在克隆领域摸索出第一种最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。
功能克隆是简单实用的方法，但是它需要已知基因信息才能进行克隆，因此最初应用功能克隆方法的时候，具有很大的局限性。
1.2定位克隆定位克隆又叫图位克隆，是人们研究出的可以克服基因编码序列未知对功能克隆限制性的一种克隆方法。
克隆技术的新进展克隆技术，作为生物科技领域中备受关注的话题，一直以来都备受质疑。
尽管克隆技术的发展成果丰硕，然而这项技术的局限性与伦理道德问题一直是被广泛关注的话题。
但是，随着科技的不断进步，克隆技术迎来了一些新的突破和进展，在生物科技领域中渐渐发挥出重要的作用。
本文将从三个方面，分别是动物基因编辑技术、植物克隆技术和人类克隆技术，来看看克隆技术在这些方面中的新进展。
动物基因编辑技术动物基因编辑技术是当前克隆技术领域中最具潜力的方向之一。
最近几年，基因编辑技术被广泛应用于动物克隆研究中。
科学家们利用基因编辑技术，遗传密码子的修改、蛋白质的修饰、基因表达的调节等方面进行了额外的实验研究。
最近牛克隆技术的进展，利用了质粒注入和Crispr-Cas9 这两种技术，实现了牛克隆基因编辑。
它们的设计方程式 C = A + B - D，改变了物种性状和性能，从而实现了育种的目标。
植物克隆技术植物克隆技术被广泛用于农业生产领域中。
植物克隆技术是通过细胞培养技术和组织培养技术，在培养环境中发出足够的细胞、组织团块，以及最终形成植株。
最近几年，植物品种改良成果丰硕，目前，植物克隆技术已经应用于食品安全，植物智能化种植和污染环境修复等方面。
例如，某些设施农场中，植物克隆技术被用来扩大某些植物品种的繁殖率，从而保证了其生产效率和订单状况。
此外，在环境修复领域中，植物克隆技术还用于优化植物的自净作用，以降低污染物质的水平。
人类克隆技术虽然人类克隆技术一直备受争议，但是其对于解决某些医学难题具有重要的意义。
技术的进步使得药物研究更为准确和有效，此外，与生殖相关的难以治愈的疾病也有可能得到有效的治疗。
例如，最近在亚洲的某些项目中，科学家成功地将人类胚胎的基因进行了编辑，使得基因突变相关的疾病治疗的前景更为美好。
同时，基因编辑技术也将有可能成为人类克隆技术研究的重要手段之一，因为基因改造可以很好地解决一些遗传难题。
总结总的来说，尽管克隆技术在实践过程中遇到了不同的困难，但是新的进展代表了这项科技的前景和未来发展的可能性。
克隆技术的研究进展克隆技术是一个备受争议的话题。
自从1996年苏格兰的罗斯林研究所成功克隆出了多利羊，这种技术就引起了人们的广泛关注和讨论。
在经过20多年的努力研究之后，克隆技术已经取得了一些重大进展，并且在许多领域有着极其重要的应用前景。
一、迄今为止的研究成果自从克隆技术问世以来，研究人员一直在试图利用这种技术来克隆更多的物种。
迄今为止，克隆技术已经应用到了多种动物的研究和应用中。
例如在研究方面，科学家们可以通过克隆技术来研究某个物种的发育和繁殖机制，从而更好地了解它们的生物学特征。
在营养方面，克隆技术可以用来繁殖高品种的畜禽，从而提高农业产量和质量，这条路上已有不少成功案例。
此外，克隆技术还可以用来繁殖家庭宠物，帮助某些物种保护、维持或改良。
二、技术创新的影响克隆技术也促进了其他相关领域的研究。
例如干细胞的研究，干细胞可以在体内不断分化和更新，拥有极大的潜力，但是在干细胞的应用过程中一直存在道德和技术问题。
干细胞与克隆技术有着很多共同点，因此研究人员可以通过对干细胞的研究，进一步探讨和改进克隆技术。
除此之外，克隆技术的不断创新，也在一定程度上影响了医学界的研究。
在医学领域中，有许多疾病是由基因突变造成的，利用克隆技术可以通过进行基因矫正，来帮助患者摆脱疾病的困扰。
目前，更少疾病可以通过这种方法的研究和实践得到治愈。
三、未来的前景在未来，克隆技术将会有更好的应用和发展。
此前，科学家需要使用胚胎干细胞来实现克隆过程，而目前研究人员已经掌握了利用成年细胞来完成克隆的方法，大大减少了成本和风险，这种技术相信将会得到更广泛的应用。
另外，目前克隆的多数对象是哺乳动物或鸟类，而对于更多的物种，如鱼和昆虫，克隆技术的研究还比较有限。
这也是未来研究人员需要重点关注的一个领域，因为克隆技术对于这些物种的重要程度和应用意义同样重要。
在此，笔者并不想探讨克隆技术的优缺点以及在生物伦理学等领域上所引发的争议。
克隆技术作为一个备受争议和极具挑战性的科学和技术领域，一定会面临许多困难和瓶颈，但是相信随着我们的不断努力，在未来克隆技术的应用领域会越来越广泛，也会给人们的生活和未来带来更多的可能性和希望。
基因克隆技术的应用现状及发展趋势近年来，基因克隆技术在各个领域得到了广泛应用，从疾病诊断、新药研发到农业改良、环境治理，其影响深远。
本文将就基因克隆技术的应用现状及发展趋势做出探讨。
一、医学领域的应用基因克隆技术在医学领域的应用有以下几个方面：1.1 疾病诊断基因克隆技术的克隆和检测能力，可以在短时间内诊断出某些难以查找的疾病。
例如，当我们怀疑某个疾病的某个基因出现了突变时，可以通过基因克隆技术，将这个基因特定区域克隆下来，进行检测，比如PCR扩增和基因测序等技术，来确定是否存在突变。
1.2 新药研发药物研发是一个漫长而复杂的过程，其中一个非常重要的部分是针对某些疾病进行药物靶点的筛选。
使用基因克隆技术可以将疾病相关基因拷贝并表达到细胞系中，接着针对这些细胞系寻找药物靶点，从而加速药物研发的进程。
1.3 基因治疗基因治疗是一种新兴的治疗方法，即将健康基因导入病人体内，以修正患有遗传缺陷的基因。
基因克隆技术可以将健康基因定点插入到患者基因组中，从而有效治疗一些遗传疾病，为人类健康做出重要的贡献。
二、农业领域的应用农业领域的应用可以归纳为以下几个方面：2.1 动植物育种基因克隆技术可以应用在动植物育种上，对育种性状进行调控。
通过基因克隆技术插入某个有益的基因，可以让动植物具有更强的抗病力、适应力、生长速度等，从而提高作物的产量和品质。
2.2 食品工业基因克隆技术可以应用在食品工业中，生产出高品质和安全可靠的食品，包括酸奶、高端咖啡、黑巧克力等。
此外，通过基因克隆技术，在农业种植过程中添加一些新的有效基因或调控植物免疫系统，可以通过提高病虫害抗性和抗旱抗寒等方面，提高农作物生产水平，保证了人类的生活质量。
三、环境领域的应用环境领域的应用可以归纳为以下几个方面：3.1 环境监测基因克隆技术可以用于制备各种检测物质和环境污染物的神经酰胺酶，从而实现污染物质的高灵敏检测。
同时，基因克隆技术还可以在水质检测和空气检测等方面发挥重要作用。
基因克隆技术的研究与进展杨孝刚（生物工程学院生物制药一班2011307040141）摘要：克隆是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程. 克隆出来的动物个体具有完全相同的遗传结构，成体细胞的核移植是一个很好的解决问题的方法。
克隆一个生物体意味着创造一个与原先的生物体具有完全一样的遗传信息的新生物体。
在现代生物学背景下，这通常包括了体细胞核移植。
在体细胞核移植中，卵母细胞核被除去，取而代之的是从被克隆生物体细胞中取出的细胞核，通常卵母细胞和它移入的细胞核均应来自同一物种。
由于细胞核几乎含有生命的全部遗传信息，宿主卵母细胞将发育成为在遗传上与核供体相同的生物体。
线粒体DNA这里虽然没有被移植，但相对来讲线粒体DNA还是很少的，通常可以忽略其对生物体的影响。
治疗性克隆的研究和完整克隆人的实验之间是相辅相成、互为促进的，治疗性克隆所指向的终点就是完整克隆人的出现，如果加以正确的利用，它们都可以而且应该为人类社会带来福音。
关键词：克隆技术；基因；克隆人；伦理；克隆的科学意义和应用价值；克隆技术在多个领域中都有所应用。
在微生物界，人们利用微生物克隆发展工业微生物。
农业微生物、酵母菌微生物、抗生素等工业，为人类的工农业生产和医疗保健事业服务；在动物界，克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是以一个福音，具有很大的应用前景。
动物克隆大体可分为二类：一类为胚胎细胞克隆，另一类为体细胞克隆。
胚胎细移植，胞克隆是指用胚胎细胞移植的方法，包括胚胎细胞和胚胎干细胞移植，以克隆出新的个体。
体细胞克隆是指将体细胞核移植到卵细胞中，以克隆出新的个体。
它包括同种体细胞克隆和异种体细胞克隆二个方面。
这些不同类型的体细胞克隆动物，都属于无性繁殖的范畴，并在科学史上具有划时代的意义；在医学界，在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植技术的，但就科学技术而言，器官移植中额排斥反应仍是最为头疼的事。
排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。
克隆技术的进展与应用克隆技术是一项引人注目的科学领域，其目的是通过复制和重建生物个体来实现基因的完全或部分一致。
自从第一个克隆哺乳动物多莉诞生以来，克隆技术在生物医学、农业、环境保护等领域取得了巨大的进展和广泛的应用。
本文将探讨克隆技术的进展与应用。
一、动物克隆技术的进展动物克隆技术是克隆技术中最为广泛和成熟的应用之一。
自从多莉被成功克隆以后，科学家们相继成功地克隆了很多其他的哺乳动物，如猴子、猪、牛等。
这些成功的克隆实验为研究基因功能、药物开发以及物种保护提供了有力的工具和手段。
在研究基因功能方面，克隆动物被广泛应用于基因表达、基因突变和功能研究等方面。
通过将特定基因改变或删除后将其植入克隆胚胎中，科学家们可以观察到这些基因对个体生长、发育以及行为的影响，从而深入了解基因的功能机制。
在药物开发方面，克隆动物被用作药物毒理学研究和新药试验的模型。
由于克隆动物具有相同的基因组，所以对药物的反应和药物毒性也会高度一致。
通过在克隆动物身上进行药物实验，科学家们可以更准确地评估药物对人体的影响，加快新药研发的进程。
在物种保护方面，克隆技术为濒危物种的繁育提供了新的希望。
通过克隆技术，可以复制濒危物种的个体，增加其种群数量，提高物种的生存机会。
例如，2018年中国科学家成功地克隆了长臂猿，为长臂猿的保护工作作出了积极贡献。
二、植物克隆技术的进展与动物克隆技术相比，植物克隆技术的发展相对较早。
通过植物的无性繁殖和组织培养等技术手段，可以实现植物的克隆繁殖，无需通过传统的播种和交配。
植物克隆技术在农业和林业领域有着广泛的应用。
在农业方面，植物克隆技术可以帮助提高作物的品质和产量。
例如，通过克隆技术可以快速繁殖优良的农作物品种，加快新品种的培育和推广。
此外，植物克隆技术还可以用于病虫害的防治，通过克隆繁殖抗病虫的植物，提高农作物的抗病虫能力。
在林业方面，植物克隆技术可以应用于森林资源的保护和恢复。
通过克隆繁殖珍稀濒危的树木，可以保护和扩大这些树种的种群数量，提高森林的生态稳定性和保护效果。
克隆研究的方法和技术进展克隆研究是指通过核移植或其他技术手段，将一个个体的某个部分或整个基因组复制到另一个个体中，从而产生与原个体基因相同的克隆个体。
自从在1996年首次成功克隆出哺乳动物——多莉羊，克隆研究就一直备受关注。
随着时间的推移，克隆研究的方法和技术也不断发展和进步。
本文将重点介绍目前主要应用于克隆研究的方法和技术进展。
核移植是克隆研究中最常用的方法之一。
核移植是通过将供体细胞核移植到无性染色体的卵细胞或早期胚胎中，然后通过激活和发育来产生克隆个体。
该技术的关键是细胞核的去核和染色体的去除。
过去，科学家主要使用纤维细胞作为供体细胞，但现在越来越多的研究证明，使用其他细胞类型，如干细胞和生殖细胞等，也能实现核移植。
此外，随着基因编辑技术的发展，可以在核移植前对供体细胞进行基因修饰，从而使克隆个体具有特定的基因特征。
另一种克隆研究方法是胚胎分裂。
该方法通过将早期胚胎（通常在4-8细胞阶段）进行机械或化学分裂，使每个子细胞分裂成独立的胚胎。
然后，这些分裂后的胚胎被植入到代孕母体中，继续发育成为克隆个体。
胚胎分裂方法比核移植更容易实施，但没有核移植方法能够获得的克隆个体数量多。
此外，胚胎分裂方法产生的克隆个体会有一定的基因差异，因为细胞分裂不是完全对称的。
除了核移植和胚胎分裂，近年来，一种新兴的克隆研究方法是细胞重编程。
细胞重编程是指将成熟细胞重新转变为多潜能状态的过程。
通过诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的生成，科学家可以实现从成熟细胞到多潜能细胞的转化，然后再将这些多潜能细胞分化为不同的细胞类型，并用于克隆研究。
这种方法避免了使用供体细胞和代孕母体，有望解决伦理和法律等方面的争议。
然而，细胞重编程仍处于发展初期，还需要进一步的研究和改进，以提高其效率和安全性。
除了方法的进展，克隆研究中的一项关键技术是体细胞核移植改进技术。
体细胞核移植是指将供体细胞核移植到卵母细胞中，然后发育成胚胎，并最终产生克隆个体。
细胞生物学基因克隆技术的最新进展细胞生物学基因克隆技术是一项重要的生物学研究领域，它可以帮助科学家们更好地理解基因的功能和调控机制。
近年来，随着科技的不断进步，基因克隆技术也取得了许多令人瞩目的突破。
本文将介绍细胞生物学基因克隆技术的最新进展。
一、CRISPR-Cas9技术的应用CRISPR-Cas9技术是目前最为热门的基因编辑技术之一。
它利用一种特殊的酶系统，即CRISPR-Cas9系统，可以精确地编辑细胞的基因序列。
通过引入CRISPR-Cas9系统，科学家们可以实现对基因组的精确编辑，包括基因的插入、删除和修复等操作。
这项技术的突破性在于其高效性和简便性，使得基因编辑变得更加容易和快速。
最近，科学家们在CRISPR-Cas9技术的基础上进行了一系列的改进和创新。
例如，他们发展出了基于CRISPR-Cas9的基因组范围编辑技术，可以同时编辑多个基因，从而实现更复杂的基因调控。
此外，科学家们还利用CRISPR-Cas9技术开展了基因组筛选研究，帮助我们更好地理解基因的功能和相互作用。
二、单细胞基因组测序技术的突破单细胞基因组测序技术是一种可以对单个细胞进行基因组测序的技术。
传统的基因组测序技术通常需要大量的细胞样本，而单细胞基因组测序技术可以在单个细胞水平上进行测序，从而可以更好地研究细胞的异质性和个体差异。
近年来，科学家们在单细胞基因组测序技术方面取得了一系列的突破。
他们发展出了一种新的测序方法，称为“单细胞全基因组测序”，可以对单个细胞的整个基因组进行测序。
这项技术的应用范围非常广泛，可以用于研究肿瘤细胞的异质性、发育过程中的细胞分化以及神经系统的发育等。
三、基因组编辑技术的发展除了CRISPR-Cas9技术外，还有许多其他的基因组编辑技术也取得了重要的进展。
例如，锌指核酸酶（ZFNs）和转录活化因子效应器核酸酶（TALENs）等技术可以实现对基因组的精确编辑。
这些技术在基因治疗和基因工程领域具有重要的应用前景。
克隆技术生命科学的突破性进展克隆技术是一种通过复制DNA、细胞或物种等来产生与原始个体相同的复制品的技术。
近年来，克隆技术在生命科学领域取得了突破性的进展，不仅在动植物繁育、医学研究以及保护濒危物种等方面产生了重大影响，也为人类在解决一系列传统问题中提供了新的可能性。
首先，克隆技术在动植物繁育方面的应用已经取得了巨大的成功。
传统的繁育方法通常需要等待大量的时间和大量的劳动力，而且有时候会遇到一些困难，例如繁殖率低下以及遗传性疾病等。
然而，克隆技术可以通过复制一种优良品种的基因，来大幅度提高生产效率并改善品种质量。
目前，已经有多种动植物通过克隆技术被成功繁殖出来，例如克隆牛、克隆绵羊等。
这些克隆品种不仅能够提供更高的产量，还具有更强的抗病能力，极大地促进了畜牧业的发展和改善。
其次，克隆技术在医学研究方面也取得了令人瞩目的进展。
通过克隆技术，科学家们能够获得大量、相同的实验样本，从而提高了实验的可重复性和准确性。
此外，克隆技术还可以用于研究遗传疾病的发生机制和治疗方法。
通过克隆动物模型，科学家们可以模拟某些遗传疾病在动物身上的表现，进而深入研究其发展过程和可能的治疗途径。
这对于人类疾病的早期预防和治疗意义重大。
此外，克隆技术还为保护濒危物种和恢复生态平衡提供了新的手段。
许多濒危物种由于环境破坏和过度捕猎等原因面临灭绝的危险，而克隆技术可以帮助科学家们保存这些物种的基因信息，并在必要时复制出新的个体。
这种方法不仅能够保护物种多样性，也为生态系统的恢复提供了有力的支持。
例如，克隆土豆鲀鱼等海洋珍稀物种，为保护和恢复海洋生态系统作出了突破性的贡献。
除了以上应用，克隆技术还在其他一些领域取得了重要突破。
例如，克隆植物技术可以用于改良农作物，提高耐逆性和产量；克隆细胞技术可以用于组织工程和再生医学，促进器官移植和人体再生；克隆微生物技术可以用于污水处理和资源回收等。
可以说，克隆技术在生命科学领域的应用前景非常广阔。
第6卷第4期(专辑) 2002年12月生命科学研究Life Science ResearchVol.6No.4(Suppl.)Dec.2002基因克隆技术的研究进展X钟军,李,官春云(湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128)摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价.这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术.关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05Advances in Gene Cloning TechniqueZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun(T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China)Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level.Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method(Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152)克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等.1差异表达基因分离技术1.1扣除杂交技术扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s Y染色体的DNA.该法的缺点是技术要求较高、工作量大,并且有时得出的数据不大可靠.然而经过多年的改进,扣除杂交技术已发展成为众多克隆技术的基础,很多克隆技术都是从此技术衍生发展而来,如抑制性扣除杂交技术.它是先将样本mRNA和参照mRNA分别逆转录成c DNA,用4种碱基识别并酶切两种cDNA以产生平端片段;样本mRNA分布接上接头1和接头2,并与过量的经Rsa1消化的参照样本杂交;在接头处设计引物,使具有差异表达的片段成为PC R扩增的模板,重复杂交以减少非特异性扩增片段,利用接头上的酶切位点进行克隆和测序.1.2差式筛选技术分别从有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样中提取mRNA经逆转录形成cDNA,并构建有特异性表达基因的目标样的cD-NA文库,再分别用有特异性表达基因的目标样和无特异性表达基因的参照样的c DNA探针与有特异性表达基因的目标样cDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交,选出只与有特异性表达基因的目标样杂交的克隆,即为有特异性表达基因的目标样特异表达的克隆.此技术要经过多轮菌斑杂交,不仅费力费钱,重复性差,而且灵敏度低.1.3差异显示PC R差异显示PCR[2]是1992年由Liang报道的.此法的主要原理是由mRNA-PCR共同组成的,利用大多数真核细胞基因的mRNA结尾处有poly (A)结构,在其3c端设计5c poly(T)引物,该引物可与mRNA结合,从而使这部分的基因达到转录.然后从两种不同类型的细胞中分离mRNA,作反转录,比较PCR产物后即可克隆目的基因.其具体操作为:用一套锚定引物反转录每一部分材料后,再分别用这一套锚定引物和随机引物从反转录的每一部分材料中扩增cDNA,电泳分离产生扩增片段后再扩增两种不同状态下有差异的片段,并且进行克隆和测序.如果采用同位素标记的方法,在凝胶电泳或放射自显影照片上就可发现不同长度的扩增产物.该技术能快速地显示细胞mRNA的组成,可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示,并且所用mRNA量少;可以立即对扩增的cDNA进行测序和克隆及与探针标记、杂交和文库筛选.它的缺点是假阳性条带较多、对丰度低的基因表达不容易检测,无法定量研究;基因的克隆受mRNA表达时效的影响;其扩增出的条带往往是在基因的3c端有比较短的一段序列,这部分序列往往是在基因3c UTR区,所提供的信息比较少,为得到cDNA必须进行cDNA文库的筛选.PC R技术的发展和应用为差异表达基因分离技术注入了新的活力.如在差式筛选技术中引入了PCR[3],不仅提高了效率,还降低了假阳性.L-i sitsy[4]等将PCR引入扣除杂交,发展了扣除扩增方案,同时用特异性引物结合技术在PCR中选择性地扩增差异cDNA,形成了代表差示分析法; Straus等[5]受扣除杂交的启发,提出了基因组扣除方案,若目的基因存在该基因缺失的突变体,就可以用变性的野生型基因组DNA与缺失基因组DNA进行扣除杂交,纯化出/多余的DNA片段0,然后设计引物进行扩增、富集、制备探针,筛选侯选基因的DNA文库.以上方法在具体操作中也可结合起来使用,如Kang等[6]利用扣除杂交后的RNA或DNA样品进行差异显示PCR,发展了交互式差减差异RNA显示技术,成为一种高效、快速克隆差异表达基因的方法.2转座子标签技术转座子是McClintock首先在玉米中发现的,以后在金鱼草、飞燕草、甜豌豆、细菌、酵母、拟南芥和一些多细胞绿藻等植物中也发现了转座子的存在[7].由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针,从纯合突变株构建的基因组文库中筛选含该转座子的同源片段,并获得含有部分突变株DNA序列的克隆,进而以该DNA为探针,筛选野生型的基因组文库,最终得到完整的基因(图1).在植物中利用的转座子有:Ac P Ds、En P Spm和Mu-tator,其中应用最多的是Ac P Ds双因子系统.Johal 等[8]利用转座子克隆到玉米抗圆斑病基因HM1,这是第一个克隆的功能产物未知的植物抗病基因;Jones等[9]利用Ac P Ds系统克隆到番茄抗叶霉病基因c-f9;Aarts等[10]利用En P Spm克隆到拟南芥菜的一个雄性不育基因;Cui等[11]利用Mutator 克隆到了玉米胞质一个恢复基因.利用转座子标签技术在克隆植物抗病基因方面也获得了巨大成果(表1).80年代中期人们在了解转座子的遗传特性和分子结构的基础上,开始用转座因子作为分子标签来分离由于它的插入而引起突变的基因,它的优点在于:1)分离基因不需要预先知道被标签产物的结构、性质,因此那些背景尚不清楚的如发149第4期钟军等:基因克隆技术的研究进展图1 转座子标签法克隆基因的过程Fig.1 The process of cloning gene in transposon tagging育、抗病及与生理过程有关的基因都有可能用此法来分离;2)转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复;3)由于转座子总是沿其邻近的位点转座,因此只要转座子在染色体上定位后,就很容易确定与其连锁的突变基因的相对位置;4)如果把转座子导入目标植物,通过自交、杂交、回交等方法便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体;5)把转座子导入异源植物不受转化条件的限制.但由于一些植物存在内源转座子,像金鱼草、拟南芥、玉米等,因而利用和植物本身同源的转座子转座就不能真正标签基因的转座,所以转座子标签技术多用于异源植物;另外转座子在不同植物中转座的频率和活性相差很大,并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体,植物基因组中多拷贝基因的存在也限制了转座子标签技术的应用.因此,许多科学家正致力于转座子系统的改进以提高转座子的标签效率和提高突变的频率.在这方面研究较多的是Ac P Ds 系统.首先对Ac 转座子作适当的修饰:去掉Ac 两端200bp 的任一端,Ac 转座子就不能发生转座,成为稳定型;其次,把Ac 转座酶基因的启动子去掉,换成35S 强启动子,这样可以大大提高Ac 转座酶的转录速度,从而提高转座子的切割频率和转录效率;第三,构建非自主转座子;最后,人们又将Ds 与特异重组系统Cre P lox 成功地结合,把C re P lox 重组系统的一个lox 位点放在Ds 内部,同时将另一个lox 克隆在T -DNA 区,Ds 转座到T -DNA 附近后,这两个lox 位点再经Cre 的反式作用而重组,使T -DNA 和Ds 之间的DNA 产生重排,可使突变率提高,还可引起位点特异突变.表1 已克隆到的植物抗病基因Table 1 Resistance gene cloned in plant植物Plant 基因名称Gene names 克隆方法Cloning method 植物Plant 基因名称Gene names 克隆方法Cloning method 植物Plan t 基因名称Gene names 克隆方法Cloning method 拟南芥Eds1转座子标签法亚麻L6转座子标签法番茄Pto 图位克隆法RPS2图位克隆法M 转座子标签法Fen 图位克隆法RPS5图位克隆法Rp1-D 转座子标签法Prf 图位克隆法RPP1图位克隆法玉米Hm1转座子标签法C-f 2图位克隆法RPP5图位克隆法Hm2图位克隆法C-f 4图位克隆法RPP8图位克隆法水稻Xa21图位克隆法C-f 5图位克隆法RPM1图位克隆法Xa1图位克隆法C-f 9转座子标签法NPP1图位克隆法P-i b 图位克隆法I2C 图位克隆法烟草N转座子标签法小麦Cre3图位克隆法甜菜Hsl Pro -1图位克隆法3 图位克隆技术图位克隆技术是近几年随着各种植物的分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的基因克隆技术,是根据功能基因组中都有相对稳定的基因座,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库(包括YAC 、B AC 、TAC 、PAC),从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,并通过遗传转化试验证实目的基因的功能(图150 生 命 科 学 研 究 2002年2).随着各种植物的高密度遗传图谱和物理图谱的建立,图位克隆技术在植物的基因克隆中有着广阔的应用前景.图位克隆首先被用于模式植物拟南芥上,Giraudat 等成功地克隆了与拟南芥种子形成和发芽有关的脱落酸信号传导基因ABI3[12];Arondel 等则克隆到拟南芥脂肪酸脱饱和基因酶基因FAD3[13];而番茄的Pto 基因是第一个用图位克隆法克隆到的抗病基因[14],图位克隆技术的发展加速了抗病基因的克隆(表1).然而,此技术的缺点是:如果要构建完整的基因组文库,建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系,对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低,因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上.随着比较基因组学的兴起,可以利用同科异种间染色体的共线性,通过比较基因组分析和染色体登陆法,将控制该物种有关性状的基因或分子标记直接定位在它的分子标记连锁图谱中,如利用小麦与水稻基因组间的同线性,将小麦控制开花时间的基因(URN)和控制谷粒硬度的基因(HA)定位在第5组染色体上,并利用水稻图谱信息筛选水稻小麦同线区的BAC 文库或YAC 文库,用于测序进而搜索侯选基因[15];另外也可以利用同科异种间染色体的共线性以模式植物为种间图位克隆中介来克隆其他植物基因.可以预测,在不久的将来,在比较基因组学中统一遗传系统理论的指导下,在具有高多态性水平的以PCR 为基础的分子标记日渐成熟的背景下,在作物的研究中应用图位克隆技术必将有更大的成果.图2 图位克隆技术克隆基因的过程Fig.2The process of cloning gene in map -based cloning technique4 同源序列技术这是一种克隆抗性基因的新策略.根据基因家族保守氨基酸序列设计兼并引物,并用兼并引物对含有目的基因的DNA 文库进行扩增、再对扩增产物进行扩增、克隆和鉴定,如通过对已克隆的抗性基因蛋白序列的分析,发现这些抗病基因所编码的蛋白都存在同源序列,如富含亮氨酸重复区(LRR)、核苷酸结合位点(NBS)、蛋白激酶(PK)等,所以人们设想用同源序列来克隆新的抗病基因.王石平[16]等根据这些保守序列设计合成了特异性和兼并性引物,对水稻基因组DNA 进行扩增,得到了100个大小不同的克隆,定位了26个克隆,其中的10个克隆与8个已定位的水稻抗病基因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻,表明这些克隆的抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系,证明了同源序列分离和克隆基因的可能性.黄烈健[17]等根据已克隆的抗病基因同源序列设计引物,对玉米DNA 进行扩增、克隆并对部分克隆进行测序,测序结果与Genbank 进行了序列同源的比较,两者同源性达85%以上.此法的长处在于:若同源序列与抗病基因紧密连锁或带有抗性基因的同源序列,则可用其作探针来筛选基因组文库,获得侯选基因,但植物基因组中有许多与LRR 或NB S 同源的区域,其功能并不都是与抗病有关.所以,该技术应与图位克隆技术结合使用.同源序列技术存在的问题也是值得重视和思考的:1)由于密码子的兼并性和不同同源序列间同源程度的差异,兼并引物的特异性要设计得当;2)由于某些同源序列并不专属于某一家族,因而扩增产物不一定是某一基因家族的成员;3)基因家族成员成簇存在,克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断.因此对PC R 扩增产物和克隆产物,有必要进行基因与性状共分离分析、插入失活或遗传转化等功能鉴定,以便最终筛选到目的基因.151第4期 钟 军等:基因克隆技术的研究进展5表达序列标签技术(EST)EST是完整基因上能特异性标记基因的一部分序列,通常包含了基因足够的结构信息区,从而与其它基因相区分,大规模EST克隆和资料库的建立,为利用生物信息学克隆基因提供了条件.其基本原理是从组织特异性或细胞特异性的DNA 文库中随机挑选克隆,并进行5c和3c端部分测序,通过对基因库的检索,可以检测所测序以及翻译的多肽氨基酸序列与基因库中已知的是否有同源性,最后对发现的新基因进行突变检测和表达分析.这样不仅可检测到许多已知的基因,更可以发现许多未知的基因.该技术建立在大量已有的生物信息资源基础上的,同时,结合了目前的新技术,为大规模克隆基因提供了捷径.目前,国际上大部分的基因克隆是从分析同源EST开始的,如田芳[18]探讨了如何利用EST发现并克隆肿瘤基因;Okano[19]利用此技术克隆到一簇新的哺乳动物的DNA-5胞苷甲基转移酶基因;Dymock等通过EST数据库分析克隆到细胞分裂素的1个跨膜突变受体基因GCR1[20].另外,可利用对体细胞杂交体DNA进行扩增来达到EST在染色体上的定位.美国密执安大学利用此法将36个EST定位于人的第6号染色体.EST具有广泛的用途.利用对独立EST的拼接可获得新基因的全长cDNA序列;利用EST标签克隆的斑点杂交可鉴定涉及组织或器官发育过程不同阶段各个基因表达的不同,与其它差别杂交方法相比,它能进行初步筛选和鉴定,因而节省了时间;由于事先获得了某个基因的E ST,所以可加速对该基因的克隆以及序列测定;通过构建cDNA文库,可得到有关植物的EST,从而可了解植物生长发育过程中不同的基因表达,为植物育种改良打下基础.参考文献(References):[1]LA MAR H R.Y-encoded,species-s peci fic DNA in the mice:env-idence that the Y chormosome exists in two polymorphic forms i n hy-brid strains[J].Cell,1984,37:171-177.[2]LIANG P,PARADEE A B.Differential display of eukaryotic mess-rnger RN A by means of the polymerase 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