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基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
Word-可编辑第八章基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学主意，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、衔接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中举行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个残破的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外衔接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。
第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA衔接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。
千里之行，始于足下三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞举行扩增和表达的DNA,它们普通是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA 分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
1. 简述基因工程中的四大要素。
答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。
2. 简述基因工程诞生的基础。
答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。
1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。
1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。
理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。
第二章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。
2.II型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。
第九讲目的基因的克隆中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDNA基因克隆1．概述2．cDNA文库的构建3．低丰度mRNA之cDNA克隆4．稀少mRNA的cDNA克隆5．全长cDNA的合成6．cDNA克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFLP分子标记3．RFLP作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。
严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。
*要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。
因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。
*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：a.DNA材料的选择与片段化；b.外源DNA片段与载体分子的连接；c.重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。
2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，这是中文的一个有别于英文的地方。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
22楼一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。
各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。
这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。
第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。
它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。
其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。
因此以下内容均以II 类限制性内切酶为主。
1．限制性内切酶的命名和书写限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
现在通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。
比如限制酶HincⅡ和HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c 和d 血清型菌株。
如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，如表2.1 所示。
2．限制性内切酶的特点：①识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。
例如：②具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。
通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。
③由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。
对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。
换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。
例如，限制酶BamH I 和BglⅡ都能识别各自的6 核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC 和AGATCT，因此产生的DNA 片段都产生一个相同的单键5’端突出 (突出序列是GATC)。
当这些酶作用DNA 分子后，它们都能相互连接，但是新形成的DNA 分子将同时失去这两种酶的识别序列。
如：通常，不同的限制酶具有不同的识别序列，但有些不同来源的酶能识别相同的序列，这些酶被称为同裂酶（isoschizomer），不过其中有些酶具有相同的切点，而有些酶的切点却并不相同，如Acc Ⅲ与BspEⅠ、BseAⅠ、B siMⅠ、Bsp 131、Kpn21、MroⅠ识别序列都是TCCGGA,t 它们的切点都在T 和C 之间，即T/CCGGA；但BbeⅠ与KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ识别序列都是GGCGCC，但它们的切点分别为GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。
现在已从各种微生物中发现三千余种限制酶，它们识别序列的长度最短的是4 个核苷酸，最长的为8 个核苷酸。
基因克隆过程中使用频率最高的是识别6 个核苷酸的限制酶。
这是因为由4个核苷酸组成的识别序列在DNA分子中出现的频率很高，如果按完全随机分布的原则，每44＝256个核苷酸可出现一个相同的4 核苷酸识别序列。
如果是由6 个核苷酸序列组成的限制酶识别位点，那么就应该有46＝4096 bp才可能出现一次。
识别8 个核苷酸的限制酶识别位点就应该有48＝65,536 bp才重复一次。
因此，在一个DNA分子中，识别4 个核苷酸的限制酶位点太多，识别8 核苷酸的限制酶位点又太少。
换句话说，识别4 核苷酸的限制酶将DNA切得太短，识别8 个核苷酸的限制酶将DNA切得太长，而识别6 个核苷酸的限制酶则比较适中，切下的DNA片段平均长4.1 kb左右。
除此之外，片段过长或过短，从技术角度讲，操作起来也不太方便。
实际上，任何一种生物基因组的DNA 分子中的核苷酸分布并不是完全随机的。
也就是不同物种的基因组DNA 中，所含的限制性内切酶位点的种类和数量各不相同。
也正由于此，可以通过绘制限制性内切酶图谱来描述某一个物种的基因组特征，即物理图谱。
应用限制性内切酶注意事项：酶单位（U）的定义：在50μl 反应液中, 37℃保温1h, 使1μg 的特定DNA 完全分解所需的酶量为1 个活性单位。
由于酶的活性与其所处的反应条件有很大的关系，因此在使用限制性内切酶需注意：①反应条件：每种酶所需的最适条件各不相同，包括：温度、不同的离子浓度、pH、还原剂等，因此为了保证酶处于最佳反应条件，每种酶必须备有配套的缓冲系统（buffer）。
②DNA 的纯度是影响反应效率的主要因素，杂质包括：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、以及高浓度的盐离子。
降低污染的办法：适当增加酶的用量、扩大反应体积（通过稀释降低污染物的浓度），或延长反应时间。
③注意甘油的浓度(酶储液)，所提供的缓冲液均为10 倍浓缩液，目的是保证稀释的酶保存液中甘油的浓度不会超过5 %。
但较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响，因此酶切反应体系不宜在体积过小（如小于20μl）范围中进行。
④注意反应液的充分混合，但不可振荡。
反应液充分混合是为了保证反应完全，推荐用取液器反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心即可。
上述只是一些基本原则，实际操作中需要综合考虑。
一些大的试剂公司均会提供各种限制性内切酶的详细资料。
特别强调的是，并不是酶量越多越好，反应时间越长越好，因为限制性内切酶都有Star 活性，即发生非特异性的反应（所谓Star activity，是在一些特定的条件下，酶对底物DNA 的特异性可能降低，以致在识别序列以外的位点进行切割。
在甘油含量高、酶量大，有机溶剂以及盐浓度低时容易发生）；同时酶在保温过程中，活性也会发生变化。
为了能够正确的利用限制性内切酶，应该注意阅读产品说明书以及相关的介绍。
例如：各种限制性内切酶在保温过程中的活性变化表；双酶切反应时的通用缓冲液使用表；不同缓冲液中各种限制性内切酶的活性变化表等等。
另外需要注意的是，不同公司产品的酶和缓冲液不要混用。
（见附录四－1，常用限制性内切酶表）在多数情况下，同一种限制性内切酶所产生的DNA 双链末端结构总是相同的，因而用同一种限制性内切酶酶切同一个或两个不同来源的DNA 分子所产生的末端都可以相互配对，在DNA连接酶的作用下，3’和5’末端重新形成磷酸二酯键，而成为一个重组的DNA 分子。
由于这些限制性内切酶的识别序列都是对称的，因而两个DNA 片段可以从两个不同的方向连接起来。
这种外源DNA 片段的插入没有一定的方向，这对插入片段的方向并不显得重要时适用，如在构建基因文库时。
然而在研究基因表达时，考虑外源DNA 的插入方向则是十分重要的，需要采取不同的方式进行控制，以达到定向连接的目的。
虽然不同种的限制性内切酶产生的DNA 双链末端结构在大多数情况下是不相同的，但有些不同种限制性内切酶产生的末端却是相同的，即具有相同类型的突出末端(都是5’端或3’端突出)，突出的核苷酸数目相等且序列也相同，因而可以互相连接起来。
这种由不同种的限制酶产生的能相互连接的末端常称之为相容性末端，这些酶则称之为同尾酶（isocaudamer）。
比如，在SV40 ( Simian vacuolating virus，猿猴空泡病毒)的DNA 分子中 (基因组长为5,243 bp)仅有一个Hpa II 位点 (识别序列为C↓CGG)，而Tha I 位点 (识别序列为CG↓CG) 则根本没有。
但是，在大小相似的原核生物DNA 分子中，如最常见的大肠杆菌质粒载体pBR322 (总长4,363 bp)则有26 个Hpa II 位点和23 个Tha I 位点。
在一个含有75% AT 和25% GC 的DNA 分子中，长达262,144 bp 中只有一个Sma I 位点 (识别序CCC↓GGG)。
