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基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
Word-可编辑第八章基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学主意，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、衔接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中举行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个残破的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外衔接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。
第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA衔接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。
千里之行，始于足下三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞举行扩增和表达的DNA,它们普通是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA 分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
1. 简述基因工程中的四大要素。
答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。
2. 简述基因工程诞生的基础。
答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。
1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。
1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。
理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。
第二章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。
2.II型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。
第九讲目的基因的克隆中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDNA基因克隆1．概述2．cDNA文库的构建3．低丰度mRNA之cDNA克隆4．稀少mRNA的cDNA克隆5．全长cDNA的合成6．cDNA克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFLP分子标记3．RFLP作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。
严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。
*要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。
因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。
*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：a.DNA材料的选择与片段化；b.外源DNA片段与载体分子的连接；c.重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。
2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，这是中文的一个有别于英文的地方。
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
基因克隆科技名词定义基因克隆经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
从基因组或DNA中分离单个基因，并在细胞中复制拷贝的过程。
基因克隆(gene cloning)是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。
基因克隆-基因基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。
基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。
基因克隆-基因克隆技术基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。
美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。
1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。
简述基因克隆的两个基本特征？基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子（一般情况下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。
如何理解 gene 及其产物的共线性和非共线性？基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。
当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。
在原核生物中，基因及其产物是共线性的。
70 年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子。
内含子指真核生物基因中不能被翻译成蛋白质的 DNA 片断，但可被转录，当两侧序列的转录 RNA 被剪接在一起时，就将内含子转录的 RNA 从整个转录物中除去。
外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。
内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个 DNA 片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可以作为外显子。
什么是 gene cloning ？什么是亚克隆（subcloning）？基因克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切，消化等步骤，分离带有目的基因的 DNA 片段。
基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
假如从一个原核生物中 cloning 某基因（1-2kb），请谈谈它的基本步骤？①对原核生物染色体 DNA 进行不完全酶切，纯化所得到的 DNA 片断，并与载体连接，转化大肠杆菌；②得到转化子后，根据目标基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；③所得到的转化子中含有目标基因，进一步作亚克隆，一步步地向目标基因逼近，最后可得到目标基因什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈 Gene Engineering 诞生的基础？基因工程（Gene Engineering ）又称基因操作（Gene Manipulation）、重组 DNA 。
基因克隆载体一、基因克隆载体（gene clone vector）的概念：能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体。
二、基因克隆载体应具备的条件：1、在合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点。
2、能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA的复制而同步复制。
3、必须含有供选择转化的标记基因。
4、克隆载体必须安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。
以pBR322质粒载体为例，说明以上三个特点：三、基因克隆载体发展阶段：第一个阶段：质粒载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒载体为主。
特点在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高，单克隆容量有限，一般小于45kb。
第二个阶段：主要是酵母人工染色体、细菌人工染色体、源于噬菌体P1的人工染色体、人类/哺乳动物人工染色体。
特点：载体的容载能力扩大，达100kb至几个Mb。
第三个阶段：双元细菌人工染色体和可转化人工染色体。
特点：载体的容载能力大，具备转化植物的功能。
四、几种不同类型的载体以及载体的特点：1、大肠杆菌质粒载体A. 大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，能够在转化的大肠杆菌中按质粒复制的形式进行复制。
如：pBR322、pUC18/19。
特性：a. pBR322 大小为4.363kb为松弛型质粒，复制起始点来源于pMB1。
b. 四环素抗性基因（Tet r)来源于pSC101。
氨苄青霉素抗性基因（Amp r）来源于pSF2124 。
c. 8种限制性内切酶的单一识别位点。
分别位于Tet抗性基因和Amp抗性基因中。
优点：a. 分子量小4363bp，统一规定记数从Eco R I识别位点GAA TTC的第一个T为1。
b. 两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。
Tet r基因内有5个酶切位点，Amp r基因内有3个酶切位点，Ori 内有2个酶切位点。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
22楼一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。
各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。
这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。
第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。
它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。
其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。
因此以下内容均以II 类限制性内切酶为主。
1．限制性内切酶的命名和书写限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
现在通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。
比如限制酶HincⅡ和HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c 和d 血清型菌株。
如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，如表2.1 所示。
2．限制性内切酶的特点：①识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。
例如：②具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。
通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。
③由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。
对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。
换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。
例如，限制酶BamH I 和BglⅡ都能识别各自的6 核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC 和AGATCT，因此产生的DNA 片段都产生一个相同的单键5’端突出 (突出序列是GATC)。
当这些酶作用DNA 分子后，它们都能相互连接，但是新形成的DNA 分子将同时失去这两种酶的识别序列。
如：通常，不同的限制酶具有不同的识别序列，但有些不同来源的酶能识别相同的序列，这些酶被称为同裂酶（isoschizomer），不过其中有些酶具有相同的切点，而有些酶的切点却并不相同，如Acc Ⅲ与BspEⅠ、BseAⅠ、B siMⅠ、Bsp 131、Kpn21、MroⅠ识别序列都是TCCGGA,t 它们的切点都在T 和C 之间，即T/CCGGA；但BbeⅠ与KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ识别序列都是GGCGCC，但它们的切点分别为GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。
现在已从各种微生物中发现三千余种限制酶，它们识别序列的长度最短的是4 个核苷酸，最长的为8 个核苷酸。
基因克隆过程中使用频率最高的是识别6 个核苷酸的限制酶。
这是因为由4个核苷酸组成的识别序列在DNA分子中出现的频率很高，如果按完全随机分布的原则，每44＝256个核苷酸可出现一个相同的4 核苷酸识别序列。
如果是由6 个核苷酸序列组成的限制酶识别位点，那么就应该有46＝4096 bp才可能出现一次。
识别8 个核苷酸的限制酶识别位点就应该有48＝65,536 bp才重复一次。
因此，在一个DNA分子中，识别4 个核苷酸的限制酶位点太多，识别8 核苷酸的限制酶位点又太少。
换句话说，识别4 核苷酸的限制酶将DNA切得太短，识别8 个核苷酸的限制酶将DNA切得太长，而识别6 个核苷酸的限制酶则比较适中，切下的DNA片段平均长4.1 kb左右。
除此之外，片段过长或过短，从技术角度讲，操作起来也不太方便。
实际上，任何一种生物基因组的DNA 分子中的核苷酸分布并不是完全随机的。
也就是不同物种的基因组DNA 中，所含的限制性内切酶位点的种类和数量各不相同。
也正由于此，可以通过绘制限制性内切酶图谱来描述某一个物种的基因组特征，即物理图谱。
应用限制性内切酶注意事项：酶单位（U）的定义：在50μl 反应液中, 37℃保温1h, 使1μg 的特定DNA 完全分解所需的酶量为1 个活性单位。
由于酶的活性与其所处的反应条件有很大的关系，因此在使用限制性内切酶需注意：①反应条件：每种酶所需的最适条件各不相同，包括：温度、不同的离子浓度、pH、还原剂等，因此为了保证酶处于最佳反应条件，每种酶必须备有配套的缓冲系统（buffer）。
②DNA 的纯度是影响反应效率的主要因素，杂质包括：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、以及高浓度的盐离子。
降低污染的办法：适当增加酶的用量、扩大反应体积（通过稀释降低污染物的浓度），或延长反应时间。
③注意甘油的浓度(酶储液)，所提供的缓冲液均为10 倍浓缩液，目的是保证稀释的酶保存液中甘油的浓度不会超过5 %。
但较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响，因此酶切反应体系不宜在体积过小（如小于20μl）范围中进行。
④注意反应液的充分混合，但不可振荡。
反应液充分混合是为了保证反应完全，推荐用取液器反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心即可。
上述只是一些基本原则，实际操作中需要综合考虑。
一些大的试剂公司均会提供各种限制性内切酶的详细资料。
特别强调的是，并不是酶量越多越好，反应时间越长越好，因为限制性内切酶都有Star 活性，即发生非特异性的反应（所谓Star activity，是在一些特定的条件下，酶对底物DNA 的特异性可能降低，以致在识别序列以外的位点进行切割。
在甘油含量高、酶量大，有机溶剂以及盐浓度低时容易发生）；同时酶在保温过程中，活性也会发生变化。
为了能够正确的利用限制性内切酶，应该注意阅读产品说明书以及相关的介绍。
例如：各种限制性内切酶在保温过程中的活性变化表；双酶切反应时的通用缓冲液使用表；不同缓冲液中各种限制性内切酶的活性变化表等等。
另外需要注意的是，不同公司产品的酶和缓冲液不要混用。
（见附录四－1，常用限制性内切酶表）在多数情况下，同一种限制性内切酶所产生的DNA 双链末端结构总是相同的，因而用同一种限制性内切酶酶切同一个或两个不同来源的DNA 分子所产生的末端都可以相互配对，在DNA连接酶的作用下，3’和5’末端重新形成磷酸二酯键，而成为一个重组的DNA 分子。
由于这些限制性内切酶的识别序列都是对称的，因而两个DNA 片段可以从两个不同的方向连接起来。
这种外源DNA 片段的插入没有一定的方向，这对插入片段的方向并不显得重要时适用，如在构建基因文库时。
然而在研究基因表达时，考虑外源DNA 的插入方向则是十分重要的，需要采取不同的方式进行控制，以达到定向连接的目的。
虽然不同种的限制性内切酶产生的DNA 双链末端结构在大多数情况下是不相同的，但有些不同种限制性内切酶产生的末端却是相同的，即具有相同类型的突出末端(都是5’端或3’端突出)，突出的核苷酸数目相等且序列也相同，因而可以互相连接起来。
这种由不同种的限制酶产生的能相互连接的末端常称之为相容性末端，这些酶则称之为同尾酶（isocaudamer）。
比如，在SV40 ( Simian vacuolating virus，猿猴空泡病毒)的DNA 分子中 (基因组长为5,243 bp)仅有一个Hpa II 位点 (识别序列为C↓CGG)，而Tha I 位点 (识别序列为CG↓CG) 则根本没有。
但是，在大小相似的原核生物DNA 分子中，如最常见的大肠杆菌质粒载体pBR322 (总长4,363 bp)则有26 个Hpa II 位点和23 个Tha I 位点。
在一个含有75% AT 和25% GC 的DNA 分子中，长达262,144 bp 中只有一个Sma I 位点 (识别序CCC↓GGG)。
