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2021年5月第42卷第10期食品研究与开发专题论述~=~218DOI : 10.12161/j.issn.l005-6521.2021.10.034MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用赵尘培,姜琳琳* ，张建龙,陈国忠，于馨，朱洪伟,张兴晓*基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2020QC227)；烟台市重点研发计划(2020YT06000171)作者简介:赵尘培(1996-),女(汉)，硕士研究生,研究方向:乳酸菌筛选及鉴定。
*通信作者凄琳琳(1986-),女(汉)，讲师，博士，研究方向:益生菌功能研究;张兴晓(1973-)，男(汉)，教授，博士，研究方向:微生物 与免疫学研究。
(鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025)摘要:乳酸菌是健康人类及动物肠道中重要的益生菌群，在维持肠道微生态平衡方面发挥重要作用。
由于乳酸菌的益生功能具有菌株特异性，因此•准确、灵敏的分子鉴定技术对乳酸菌功能的研究十分重要。
多位点序列分型(multilocus sequence typing , MLST )是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法,能够准确地从亚种水平进行菌株分类，在鉴定物种的遗传多样性方面发挥重要作用。
该文概述MLST 技术的原理、方法、优缺点及其在乳酸菌分类鉴定及遗 传多样性方面的研究现状,为乳酸菌株的鉴定提供理论依据。
关键词：乳酸菌；多位点序列分型;鉴定;遗传多样性Application of MLST in Identification and Diversity Analysis of Lactic Acid BacteriaZHAO Chen-pei, JIANG Lin-lin *, ZHANG Jian-long, CHEN Guo-zhong, YU Xin, ZHU Hong-wei,ZHANG Xing-xiao *(School of Life Sciences , Ludong University , Yantai 264025, Shandong , China )Abstract : Lactic acid bacteria is a type of important probiotic bacteria found in the intestines of healthy humansand animals. It plays a crucial role in maintaining the dynamic equilibrium of the intestinal microecology. Because their functions are strain -specific , it is essential to develop a rapid and reliable molecular markertechnique for the identification of different species of lactic acid bacteria. Multilocus sequence typing (MLST) isa method employed for bacterial gene typing and is based on DNA sequencing. Moreover, MLST can simultaneously identify strains at the subspecies level and has been used for the analysis of the genetic diversityof lactic acid bacteria. The aim of the present study was to describe the basic principle , methods , advantagesand disadvantages of MLST, while highlighting the suitability of MLST for the identification and classification oflactic acid bacteria.Key words : lactic acid bacteria; multilocus sequence typing; identification; genetic diversity引文格式：赵尘培，姜琳琳，张建龙，等.MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用[J].食品研究与开发，2021, 42(10):218-224.ZHAO Chenpei , JIANG Linlin , ZHANG Jianlong , et al. Application of MLST in Identification and Diversity Analysis ofLactic Acid Bacteria[J]. Food Research and Development , 2021, 42( 10) ： 218—224.乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能够发酵 糖类物质最终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌。
乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
食品中乳酸菌的种类鉴定与筛选导语：乳酸菌作为一类益生菌，对人体健康有着重要作用。
在食品行业中，乳酸菌也被广泛应用于酸奶、乳酸发酵食品等产品的制作中。
但是，不同种类的乳酸菌对人体的功效和食品质量的影响也存在差异。
因此，食品中乳酸菌的种类鉴定与筛选成为了食品工业中一项重要的研究内容。
一、乳酸菌的基本特征乳酸菌是一类革兰氏阳性、非芽孢形成的厌氧杆菌。
它具有利用碳源的多样性，能够在较宽的温度和pH范围内生长，敏感于多种抗生素，但对酸和胆盐具有很高的耐受性。
乳酸菌的独特特征在于其产酸能力和产酶能力，这对于发酵乳制品中的酸度调节、食品品质和保质期具有重要影响。
二、食品中乳酸菌的种类食品中常见的乳酸菌主要包括嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、乳酸杆菌等。
这些乳酸菌在食品发酵过程中发挥着重要作用。
例如，嗜酸乳杆菌能够将乳糖转化为乳酸，起到酸度调节和抑制有害菌生长的作用；屎肠球菌则具有较强的抗菌活性，能够抑制肠道有害菌的生长；乳酸杆菌则被广泛应用于酸奶等乳制品的制作中，具有促进消化、增强免疫力等功效。
三、食品中乳酸菌的种类鉴定方法1.传统方法传统上，食品中乳酸菌的种类鉴定主要依靠生理和生化特性，包括菌株的外形特征、生长条件、产酸能力、抗菌活性等。
然而，这种方法存在着一定的主观性和局限性，无法准确鉴定不同种类的乳酸菌。
2.分子生物学方法近年来，随着分子生物学技术的发展，食品中乳酸菌的种类鉴定方法得到了极大的改进。
例如，通过PCR扩增和序列分析特定的基因片段（如16S rRNA）可以确定乳酸菌的亲缘关系和种类。
这种方法准确度高、重现性好，成为当前乳酸菌鉴定的主要手段之一。
四、食品中乳酸菌的筛选与应用1.筛选方法食品中乳酸菌的筛选一般基于其酸度产生和抗菌活性。
通过培养基和条件的优化，可以获得具有较高产酸能力和抗菌活性的乳酸菌菌株。
同时，利用基因工程技术也可以对乳酸菌进行基因编辑，增强其产酸能力和抗菌活性。
2.应用领域食品中乳酸菌的筛选和应用广泛存在于乳制品、调味品、肉制品等食品行业中。
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》一、引言乳酸细菌（Lactobacillus）是一类常见的益生菌，它们能帮助消化系统聪明，同时也可以通过促进有益的肠道微生物的生长来改善肠道健康。
因此，乳酸细菌的分类和鉴定对于研究乳酸细菌的功能和应用具有重要意义。
本文将首先介绍乳酸细菌的分类和鉴定，然后介绍乳酸细菌的实验方法。
二、乳酸细菌的分类和鉴定1. 乳酸细菌的分类乳酸细菌是属于细菌科（Bacteroidetes）的一类细菌。
它们可以分为三大类：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸乳球菌（Streptococcus）和乳酸变形杆菌（Bifidobacterium）。
每一类乳酸菌都有不同的特征，如形态、生长习性和生理功能。
2. 乳酸细菌的鉴定乳酸细菌的鉴定可以分成宏观鉴定和微观鉴定两种。
宏观鉴定可以从外观上分辨不同种类的乳酸细菌，其中包括形态、大小、色泽和膜结构等。
微观鉴定则是从细节上来识别乳酸细菌的特征，包括菌体的形态、菌落的形状、菌落的大小和染色等。
三、乳酸细菌的实验方法1. 样品采集乳酸细菌的实验方法首先要从样品的采集开始。
乳酸细菌的样品可以从食品、生物体表面、自然环境或肠道等环境中获取。
采集的样品应当及时保存，以防乳酸细菌的生长和繁殖。
2. 培养基制备乳酸细菌的培养基是乳酸细菌实验的基础，它可以保证乳酸细菌的生长和繁殖。
常用的乳酸细菌培养基有MRS培养基、MRS-glucose培养基和MRS-sucrose培养基等。
这些培养基中的成分可以满足乳酸细菌的需求，从而促进乳酸细菌的繁殖和活力。
3. 培养和筛选采集到的样品和制备好的培养基可以混合在一起，然后置于培养室中，根据规定的条件进行培养。
一旦乳酸细菌在培养基中获得了生长和繁殖的机会，就可以开始筛选。
筛选的过程可以通过诸如生长观察、生理鉴定和生化鉴定等方法来进行。
4. 分子鉴定最后，分子鉴定是乳酸细菌分类鉴定的最关键步骤。
分子鉴定可以通过PCR技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）和16S rRNA基因测序等方法准确地识别乳酸细菌的种类。
不同来源乳酸菌的分离与鉴定于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【摘要】试验从传统乳制品、仔猪粪便及鸡肠道分离到6株乳酸菌,分别命名为LS、LT、LJ1、LJ2、LZ1、LZ2.通过细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析,对6株分离菌进行鉴定及研究.结果显示LS、LT、LJ1、LZ2菌株为短乳杆菌;LJ2菌株为粪肠球菌;LZ1菌株为嗜酸乳杆菌.这6株菌株对李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌效果.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】5页(P208-212)【关键词】乳酸菌;分离鉴定;16S rDNA【作者】于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】S852.61目前由细菌引起的疾病一般都通过抗生素来治疗，但抗生素的滥用使得大部分细菌对其产生了不同程度的抗性，给疾病治疗及人类健康带来隐患。
寻找有益的抗生素替代品已成为亟待解决的问题，而以菌治菌的方法正日益被人们接受。
实践证明益生素是一种可直接饲喂动物并能促进动物肠道菌群平衡的微生态制剂，可部分替换抗生素作为饲料添加剂，有望解决抗生素残留问题及动物耐药问题，而在肠道众多菌种中，最具代表性的有益菌当属乳酸菌（罗慧等，2008）。
青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究何轶群;雷赵民;吴润;万学瑞;刁小龙;艾文娜【摘要】为筛选优良的青贮饲料添加剂,采用平板分离法从青贮饲料中分离乳酸菌,通过细菌形态学、生理生化特征鉴定和16S rRNA基因序列分析相结合的方法对分离出的细菌进行鉴定.通过产酸性试验和抑菌试验对分离出来的12株乳酸菌进行筛选,并对筛选出的6株乳酸菌进行生物学特性比较.结果显示,5株为戊糖片球菌,4株为植物乳杆菌,1株为发酵乳杆菌,1株为肠系膜明串珠菌肠膜亚种,1株为屎肠球菌；菌株B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1、B5-2的产酸能力和抑菌效果较好；菌株B1-7和B5-2生长最快,8h后进入稳定期,其余菌株14 h后进入稳定期；菌株B1-7在培养温度高于45℃,培养基pH＞10和含盐量＞0.08g/mL时不再生长,其余菌株均具有良好的抗逆性具备青贮潜力,可作为秸秆青贮的生物添加剂做进一步研究.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】7页(P177-183)【关键词】乳酸菌;16S rRNA;筛选;生物学特性【作者】何轶群;雷赵民;吴润;万学瑞;刁小龙;艾文娜【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070【正文语种】中文近几年来，我国畜牧业发展迅速，动物养殖规模日益扩大，但由于我国耕地面积减少，用于生产饲料的原料严重不足，加之对秸秆类植物的利用率相对较低，养殖业和饲料生产的矛盾日益突出，这些问题严重制约着我国畜牧业的发展。
因此，发展饲料工业以及加大对秸秆类植物饲料化的转化是目前我国畜牧业迫切需要解决的问题。
目前对秸秆类粗饲料的加工处理主要有物理加工法、化学加工法和微生物发酵法，其中以微生物发酵法中的青贮法应用最为广泛。
