细胞基因组提取方法
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细胞基因组提取方法
1, 贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。
2, 细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。
3, 重复2。
4, 加入5ml DNA提取缓冲液,(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。
5, 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀,50℃水浴3h,
6, 用等体积的酚抽提一次,2500r/min 离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min 离心收集水相。
用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。
7, 加入等体积的5mol/L 的LiCL,混匀,冰浴,10min.
8, 2500r/min,离心10min. 转上清与一离心管中。
加入等体积的异丙醇。
室温10分钟。
9, 2500r/min,离心10min。
弃上清。
加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。
-20℃20分钟。
10, 12000r/min, 室温离心5分钟。
弃上清。
将DNA溶于适量TE中。
真核细胞DNA的制备
试剂准备：
1、TE:10mM Tris-HCl(pH7.8);1mM EDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。
3、裂解缓冲液：250mM SDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、无水乙醇、75%乙醇
试验步骤：
材料处理：
1)用冰预冷的PBS洗培养细胞两次，每次2ml，冰上。
2)加入1ml PBS，用细胞刮子将细胞刮下，收集到15ml离心管中，再用500ul PBS冲洗培养皿，收集至离心管中，离心1500g，10min，4℃，去除上清液。
3)用500ul TE重悬细胞，加10倍体积（5ml）的裂解缓冲液，37℃，1hr。
4)加蛋白酶K（10mg/ml）55ul，即终浓度为100ug/ml，50°C水浴3hr。
5)加等体积饱和酚5.6ml至上述样品处理液中，温和、充分混匀10min，形成乳剂。
2、离心5000g×15min，用剪掉Tip头的吸液器取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3、再用等体积饱和酚抽屉两次或更多次。
4、加等体积酚/氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8、沉淀用75%乙醇洗涤两次，离心5000g×3min，弃上清液。
9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加（50-100ml）TE溶解过夜。
