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分子生物学课件 第四章

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现代分子生物学课件-第四章

现代分子生物学课件-第四章

tRNA上所运载的氨基酸必须靠近 位于核糖体大亚基上的多肽合成位 点，而tRNA上的反密码子必须与小 亚基上的mRNA相配对，所以分子中 两个不同的功能基团是最大限度分 离的。
4. 2. 2 tRNA的功能
转录过程是信息从一种核酸分子 （DNA）转移到另一种结构上极为相 似的核酸分子（RNA）的过程，信息 转移靠的是碱基配对。
C
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
异亮氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
A
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Ile，I
）
）
R）
）
甲硫氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
G
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Met，
）
）
R）
M）
缬氨酸
丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸
U
（Val， （Ala，A （Asn，N （Gly，
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
A
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
G
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
U
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
A
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
V）
）
）
G）

分子生物学第四章

分子生物学第四章

第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
第一节 RNA转录的概述
5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。

分子生物学第四章生物信息的传递下

分子生物学第四章生物信息的传递下
5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’ 或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’ 或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3‘ 产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。

分子生物学 第四章

分子生物学 第四章
AP内切核酸酶 产生单核苷酸切 口
DNA聚合酶 填补碱基
DNA连接酶
核苷酸切除与UvrAB修复系统
错配修复中子代DNA的识别
针对复制错误，所以发 生与子代DNA分子
一个问题：如何区分子 代DNA分子?
大肠杆菌中子代新生分 子尚未甲基化，从而可 以区分
甲基化位点： 5’-GATC-3’ A甲基化 5’-CCA/TGG-3’ C甲基化
Holliday模型的缺陷与 Meselson-Radding修正模式
Holliday模型的缺 陷：切口是如何出 现在两条分子的同 一位置的？
单分子切口 切口链侵入未打开
的双螺旋，形成D环 被取代链断开，形 成另一个分子上的 切口 修正：在两分子切 口形成过程中引入 交换的D环
Holliday模型修正后无法解释 基因转换
物理和化学诱变导致突变
化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参 与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭
物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热
突变可能不影响基因组
存在很多不影响基因组功能的突变 沉默突变：
1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域， 对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因 组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同 义突变
重组的一般类型----同 源重组（一般性重组）
位点特异性重组（同源 区很短）
转座
同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ重组
可发生于两条 同源DNA的任 意位点
真核生物中， 发生于减数分 裂时期
重组是由于异源双链体DNA间发 生断裂与重连
两条双链DNA分子间的重组关 键是单链的交换

分子生物学：DNA复制

分子生物学：DNA复制

(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min

分子生物学基础PPT第四章

分子生物学基础PPT第四章

第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物启动子对转录的影响 TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同（图4-5）。 前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或 进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区 突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。研 究SV40晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该 启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5′上 游–21－–47核苷酸序列切除，基因完全不表达（图4-6）。
分子生物学基础
遗传信息的转录—从 第四章 遗传信息的转录 从DNA到RNA 到
第一节 RNA转录的概述
一、RNA转录的特点 RNA转录的特点 在DNA指导下RNA的合成称为转录。RNA链的转 录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终 点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单 位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一 种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶 段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转 录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter）控 制，而控制终止的部位称为终止子（teminator）。 典型的转录单位结构如图4-1。
第四节
转录后加工
图4-12 真核生物mRNA5′–端帽结构
第四节
2．3′–端加尾
转录后加工
真核生物成熟的mRNA 3′–端通常都有100~200个腺苷 酸残基，构成多聚腺苷酸（polyA）的尾巴。通过研究发 现，DNA序列中没有多聚T的序列，由此说明了3′尾巴 polyA是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸 化的信号，该序列AAUAAA，因为切除该保守序列，3′–端 则不能进行切除，也不能形成polyA尾巴。3′–端polyA尾 的形成见图4-13。

华中农大分子分子生物学第4章课件

华中农大分子分子生物学第4章课件

UAG UAG UAG UAA/UAG UAA/UAG UGA/UGG
AUG AGA UAA
UCU
AUG GGA UAA
AUG AGA UAA
CCU
UCU
Arg
Gly
Gly
14-18
Contents
---- tRNA
14-7
rRNAs
70S 50S 23S=2904b
3'
5'
14-15 tRNA L
tRNA
1mRNA 2
tRNA 3'CCA-tRNA mRNA--
3' 5'
CCAOH
5'
CCG
I
3'
GGC
tRNAmRNA
tRNA
1tRNAtRNA
mRNAtRNA tRNAtRNAtRNAP111
P111P120 AUG Met AA-tRNAMet-tRNAMet AUG , AA-tRNA fMet-tRNAfMet
40S
elF-3
met
Met Met-tRNAMet-elF-2 -GTP
ATP
mRNA
elF4E, elF4G, elF4A,
elF4B,PAB
ADP+Pi
60S
eIF-2BeIF-3 eIF-6
40S
60S
Met
elF-5
Met
elF GDP+Pi
()
AA-tRNA (elongation factor, EF)
3
4
20 (�)
mRNA 5 AUCGACCUGAGC
3
42=16

现代分子生物学第四章ppt课件

现代分子生物学第四章ppt课件

密码子与反密码子的相互作用
tRNA的反密码子在核 糖体内是经过碱基的反 向 配 对 与 mRNA 上 的 密 码子相互作用的。
Codon 5’ A C G 3’ Anticodon 3’ U G C 5’ is usually written as codon ACG/anticodon CGU, ACG and CGU
遗传密码： mRNA上每3个核苷酸翻译成多肽链上 的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一 个密码子〔三联子密码〕。
4. 1. 1 三联子密码及其破译
由于mRNA中只需4种核苷酸，蛋白质中有20 种氨基酸：
以一种核苷酸代表一种氨基酸是不能够的。
假设以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码〔二 联子〕，能代表42=16种氨基酸。
假设以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种 密码子，满足了编码20种氨基酸的需求。
从遗传学的角度证明三联子密码的想象 是正确的
Crick等人发现T4噬菌体rII位点上两个基因的 正确表达与它能否侵染大肠杆菌有关，用吖啶 类试剂〔诱导核苷酸插入或从DNA链上丧失〕 处置使T4噬菌体DNA发生移码突变 〔frameshift mutation〕，噬菌体就丧失感染 才干。
mRNA上的密码子与tRNA上 的反密码子配对表示图
a. 密码子与tRNA反密码 子臂上相应序列配对
b. 当反密码子第一位是I时， 密码子第三位可以是A、U或C。
tRNA上的反密码子与mRNA上密码子的配对与“摆动〞分析
1．3'〕X-Y-C 〔5'〕
酪氨酸
3
缬氨酸
密码子个数 6 2 1 2 4 6 4 1 2 4
除了Arg以外，编码某一特定氨基酸的密码子个数 与该氨基酸在蛋白质中的出现频率相吻合

分子生物学第四章--基因工程常用工具酶

分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
A．以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列，切点不同。
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.

分子生物学 第四章 RNA的生物合成

分子生物学 第四章 RNA的生物合成

第二节 转录的基本条件
一.反应体系
含DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ 。 其中原料为四种核苷三磷酸 NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U ； 合成过程: 连续，方向：5'→3' 合成部位：细胞核内。
二.转录反应的模板 转录反应不但需要DNA作为模板， 而且不同的RNA聚合酶对DNA两股链 以及不同的DNA段落都有一定的选择 性。
RNA聚合酶对利福平(rifampicin)和利福霉 素(rifamycin)表现敏感的原因
（二） RNA聚合酶对模板的选择
RNA聚合酶对模板的选择包含两层意思。 其一是不同的RNA聚合酶转录不同的基因， 合成不同的RNA。 其二是RNA聚合酶对DNA的两股链有选择性。
转录(transcription)的不对称性就是指 转录只以双链DNA中的一条链作为模板进行转 录，将遗传信息由DNA传递给RNA的现象。
他们的研究结果不仅破除了“酶一定是 蛋白质”的传统观点，而且也破除了“RNA 的功能只是控制蛋白质的合成”这一传统 观点。 因此他们于1989年共同获诺贝尔化学 奖。 此后RNA的重要功能不断有新的发现， 从而认识到——DNA是携带遗传信息分子， 蛋白质是执行生命功能的分子，RNA则既是 信息分子，又是功能分子。
二. RNA的结构与主要生理功能
RNA几乎总是线性单链的，极少有环状RNA分子。 但几乎每个RNA分子都有许多短的双螺旋部分，称为 发夹。 除了标准的GC和AU对之外，还有较弱的GU对可帮 助单链RNA形成二级结构。
一条正在延伸的RNA链的二级结构会影响这个RNA 分子的剩下部分的合成。
一个细胞中含有许多不同的RNA 分子，其长度为50个核苷酸到数万个核 苷酸不等。

分子生物学 ch4DNA复制

分子生物学 ch4DNA复制

第四章 DNA的复制一、名词解释:1、半保留复制：DNA复制过程中，每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称为半保留复制2、半不连续复制：DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制3、Klenow片段：E.coli DNA pol I是单一肽链的蛋白质，用枯草杆菌蛋白酶水解得到一个N端的小片段和C端大片段。

大片段含有5’→ 3’聚合活性和3’→ 5’外切活性，称为Klenow片段4、复制起始点（ori）：DNA复制起始点是特定的，表现为序列特异性，并有特异性蛋白和酶与之结合，这一特异性序列称为复制起始点5、冈崎片段：DNA滞后链的复制中产生的短片段6、回环模型：DNA双螺旋同时进行复制，在复制叉处滞后链模板形成一个环，以适应双链同时进行复制，这种复制模型称为回环模型7、复制子repicon：DNA分子上一个独立的复制单位8、复制体replisome：有解旋酶、引发酶和DNA pol III全酶组成的复合体，在DNA合成时，沿复制叉方向移动9、自主复制区ARS：酵母的复制起始点称为自主复制区。

10、端粒（telemere）：真核生物染色体DNA的两端是一种重复序列的特殊结构称为端粒11、引发体（primosome）：大肠杆菌DNA复制中，由DnaB解螺旋酶和DnaG引物酶构成复制体的一个基本单位称为引发体二、填空题1.在原核生物和真核生物DNA合成中负责填补空缺的酶分别是DNA聚合酶I和DNA聚合酶ε。

2.染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为复制叉。

3.在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为DNA连接酶。

4.在DNA复制过程中，连续合成的子链称前导链，另一条非连续合成的子链称为滞后链。

5.原核生物和真核生物中主要负责复制的酶分别是DNA聚合酶III和DNA聚合酶δ。

6.DNA后随链合成的起始要一段短的RNA引物，它是由DNA引发酶以核糖核苷酸为底物合成的，在真核生物中相同功能的酶是DNA聚合酶α。

分子生物学 PPT课件

分子生物学 PPT课件


目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一
由两相组成：
第一相：等电聚焦凝胶电泳
(根据蛋白质电荷差异) 第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 (根据蛋白质分子量差异)
2-D Electrophoresis
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
课程主要内容


第一章 生物大分子的分离纯化
第二章 分子生物学常用技术（PCR、核酸 分子杂交、基因测序、生物芯片等）

第三章 基因工程 第四章 基因敲除与RNA干扰 第五章 细胞培养技术
蛋白质组和蛋白质组学
蛋白质组（proteome）是指特定细胞、组织乃至机
体作为一个生命单元中所有蛋白质的集合，即某一时
蛋白质 溶解
平衡
样品制备
2-DE 技术
图像分析技术
通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经
过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有 不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信 号。
2-DE获得的蛋白质图谱
二、蛋白质的鉴定－质谱技术

原理 样品分子离子化后，根据不同离子间的质量
和电荷比值（m/e）的差异确定分子量。
②蛋白质分离：2-DE、双向高效液相色谱、毛细管电泳等；
③图象分析； ④蛋白质鉴定：包括氨基酸组成及序列分析，用于肽质量指纹 图、肽序列标签鉴定及相对分子量精确测定的质谱技术（MS） 或MS联用技术、蛋白芯片技术等；
蛋白质组研究技术
⑤蛋白质与核酸的相互作用：凝胶阻滞分析，染色体免疫沉淀， DNAaseI足纹分析，核酸-蛋白质杂交实验；

分子生物学第四章 基因与基因组的结构与功能

分子生物学第四章 基因与基因组的结构与功能

4.2 基因命名法
但是在研究不同生物的同一遗传机制时，往往会产生一些混淆，如 在研究酿酒酵母和粟米酵母的细胞周期有关基因的命名中。此外， 许多基因在不同实验中从相同组织被分离出好几次而具有不同命名： 重要的果蝇的发育基因torpedo便是其中一例——它在筛选不同表 型的过程中三次被鉴定并被命名三种不同名称。果蝇提供了关于遗 传命名的最为丰富的例子，特别是在发育生物学中这种趋势也扩展 至脊椎动物中。
总之：顺反子学说打破了“三位一体”的基 因概念，把基因具体化为DNA分子上特定的 一段顺序--- 顺反子，其内部又是可分的， 包含多个突变子和重组子。 近代基因的概念：基因是一段有功能的DNA序 列，是一个遗传功能单位，其内部存在有许 多的重组子和突变子。 突变子：指改变后可以产生突变型表型的最 小单位。 重组子：不能由重组分开的基本单位。
（三）DNA是遗传物质：1928年Griffith 首先发现了肺炎球菌的转化，证实DNA 是遗传物质而非蛋白质；Avery用生物 化学的方法证明转化因子是DNA而不是 其他物质。 （四）基因是有功能的DNA片段 20世纪40年代Beadle和Tatum提出一个 基因一个酶的假说，沟通了蛋白质合成 与基因功能的研究 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋 结构模型，明确了DNA的复制方式。
病毒(+)股RNA为2个拷贝,基本结构为:
５＇帽－R－U5－PB － －DLS－－gag－pol－env－ (onc－)－ C－PB＋－U3－R－poly(A)n 病毒颗粒中有两条相同的正股RNA+两条来自宿主细胞的 tRNA
A：编码区:所有逆转录病毒均含有3个基本结构基因
gag: pol: 病毒核心蛋白 肽链内切酶,一个逆转录酶,一个与前病毒整 合相关的酶 env: 包膜蛋白 B：非编码区: 与基因组复制和基因表达有关 A: B: C: R区: 两端的重复序列,与cDNA合成有关 引物结合区(primer binding site, PB) U区: U3 含强启动子,起始转录RNA. U5 与转录终止和加polyA有关 D: DLS--C区: DLS:两条病毒(+)RNA链结合位点 : 包装信号:RNA装入病毒颗粒 C: 调控区.

《现代分子生物学》第四章 1 DNA 复制

《现代分子生物学》第四章 1 DNA 复制


参与复制的DNA分子上 有两个区域，未复制的 区域由亲代DNA组成， 已复制的区域由两条子 代链组成。复制正在发 生的位点叫做复制叉 （replication fork）或 生长点（growing point）。
Origins can be mapped by autoradiography and electrophoresis Replicated DNA is seen as a replication eye flanked by nonreplicated DNA.
二、DNA聚合酶（包括DNA复制酶及参与复
制的附属反应或损伤DNA的修复合成）
1 大肠杆菌的DNA聚合酶 大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶：DNA聚合 酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅰ参与损伤DNA的修复，并在半保 留复制中起切除RNA引物的作用。 DNA聚合酶Ⅱ也参与修复。 DNA聚合酶Ⅲ是一个多亚基的蛋白质，是合成 DNA新链的主要复制酶。

Semi-conservative mechanism
15N
labeled DNA
15N
labeling experiment
1. 2. 3. 4.
15N
labeling: grow cells in ?? Collect DNA: grow cells in ?? Separation: method ?? Result interpretation
第四章
DNA 复制

DNA的复制（replication）是指以原来的DNA分 子为模板合成出相同的DNA分子的过程。

遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。 DNA复制在保持生物物种遗传的稳定性方面起 着重要的作用。

分子生物学 第4章 DNA损伤与修复

分子生物学 第4章 DNA损伤与修复

•F1 Mutaagenesis
OH
H
O
Br
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
:G
1. Base analog incorporation
AGCTBCCTA TCGAAGGAT
烯醇式
2. 1st round of replication
Br
H
O
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
AGCTBCCTA TCGAGGGAT
•Molecular Biology Course
第四章
DNA的损伤、修复和重组
教学要求
熟悉突变的种类和产生的因素 熟悉DNA损伤的原因、类型 理解DNA复制忠实性的机制 掌握DNA修复的机制 理解DNA重组的方式及原理
主要内容
第一节 DNA damage (损伤)
第二节 DNA repair(修复) 第三节 Gene mutation (突变） 第四节 Recombination (重组)
•DNA lessions
d.碱基修饰与链断裂
• 细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤， 能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基 修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤。
• 每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率 约为5万次。
•DNA damage
发生在需氧 细胞中。 电离辐射会加剧这种损伤。
•DNA lessions
2. DNA的自发性化学变化
• 生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化， 至少有以下类型：
–a.碱基的异构互变
–b.碱基的脱氨基作用
–c.脱嘌呤与脱嘧啶
–d.碱基修饰与链断裂
•DNA lessions

分子生物学基础第四章遗传信息的转录—从DNA到RNA第三节转录的终止

分子生物学基础第四章遗传信息的转录—从DNA到RNA第三节转录的终止
分子生物学基础
第四章 遗传信息的转录—从DNA到RNA
第三节 转录的终止
一、不依赖于ρ因子的终止 现已查明，模板DNA上存在终止转录的特殊信号—— 终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由 这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点 前面有一段由4~8个A组成的序列，所以转录产物的3′端 为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。在新 生 RNA 中 出 现 发 卡 式 结 构 会 导 致 RNA 聚 合 酶 的 暂 停 ， 破 坏 RNA–DNA杂合链5′端的正常结构。RNA3′端寡聚U的存在 使杂合链的3'端部分现不稳定的rU·dA区域。两者共同作 用使RNA从三元复合物中解离出来（图4-9）。终止效率与 二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至 少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率 逐步提高。
第三节 转录的终止
二、依赖于ρ因子的终止
体外转录实验表明，纯化的RNA聚合酶并不能识别特 异性的转录终止信号，而加入大肠杆菌ρ因子后该聚合酶 就能在DNA模板上准确地终止转录。 ρ因子是一个相对分 子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷 酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生 RNA链从三元转录4-11 依赖于蛋白质因子的转录抗终止模式
依赖于ρ因子的转录终止区DNA序列缺乏共性，说明 该因子并不能识别这些终止位点。现在一般认为，RNA合 成起始以后ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠水解ATP产 生的能量，沿着5′→ 3′方向朝RNA聚合酶移动，到达 RNA的3′-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶， 使之从模板DNA上释放mRNA，完成转录过程（图4-10）。
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DNA Polymerase
E.coli. DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 E.coli. DNA聚合酶 大片段 聚合酶I大片段 聚合酶 （Klenow fragment） ） T4噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 T7噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 耐高温DNA聚合酶： 聚合酶： 耐高温 聚合酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶
增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒 它们一般是通过改造质粒、 增和表达的 它们一般是通过改造质粒 等构建而成的。 等构建而成的。
质粒
噬菌体
种 类
病毒 组 合 载 体
能在宿主细胞中独立复制; 能在宿主细胞中独立复制 具有多种限制酶的单一切点（ 具有多种限制酶的单一切点（ 多克隆 位点）以便外源DNA插入； 插入； 位点）以便外源 插入
具备条件
必 要 条 件
具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组 具有筛选标记 以区别阳性与阴性重组 分子; 分子; 分子较小，便于体外基因操作， 分子较小， 便于体外基因操作，同时 载体DNA与宿主 与宿主DNA便于分离； 便于分离； 载体 与宿主 便于分离
表达载体: 表达载体: 具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、 具有与宿主细胞相适应的启动子、 增强子、 加尾信号等基因表达元件。 加尾信号等基因表达元件。
氯霉素扩增－氯霉素可抑制染
色体DNA复制 色体DNA复制，但质粒复制不受影 DNA复制， 可增加拷贝数。 响，可增加拷贝数。
克隆载体pUC19质粒图谱 克隆载体pUC19质粒图谱 pUC19
克隆载体pBR322质粒图谱 克隆载体pBR322质粒图谱 pBR322
质粒 用于原核宿主的载体 噬菌体 ?
λ噬菌体经过改造去除中间 噬菌体经过改造去除中间 非必需部分可以插入大片 分子（ 段DNA它原因呢？
切除非必需的中央区 λ噬菌体 噬菌体 增减某些限制性酶切位点 插入适当的筛选标记基因 λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 置换型载体：适于克隆5-20kb的外 置换型载体：适于克隆 的外 源基因片段识别 部 位序 列 一 般为4、 或 个核苷 般为 、 5或 6个核苷 酸序列； 酸序列； ② 呈双重轴对称。 呈双重轴对称。 EcoR I
性质
切断识别部位或其附近特定部 生两种末 端 位后 ， 产 生两种末端 ， 即 平齐末端和粘性末端（ 突 平齐末端和粘性末端（5’突 出端和3’突出端）。 出端和 突出端） 突出端 Pst I
拷贝/细胞，例如 载体可达700个/细胞 拷贝 细胞，例如pUC载体可达 细胞 载体可达 个 细胞
严紧型－受受体染色体 受受体染色体DNA复制控制，拷 复制控制， 复制控制
贝数低， 几个拷贝 细胞，例如pSC101 几个拷贝/细胞 贝数低，1-几个拷贝 细胞，例如
分类
可转移型 不可转移型* 不可转移型* 兼容型 非兼容型* 非兼容型* 天然型 人工型* 人工型*
CTGC↓AG GA↑CGTC
5’突 突 出
3’突 突 出
特殊的限制酶
同裂酶isoschizomer 同裂酶
指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。
同尾酶isocaudamer 同尾酶
指识别序列不同，但切割 指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端 后可以产生相同粘端 的限制性内切酶。 的限制性内切酶。
有
有
ATP
NAD+
粘性末端连接
载体和插入片段具有相同的粘性末端 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA DNA分子 容易连接成环状的重组DNA分子 可在连接前， 可在连接前，用碱 可能出现问题： 可能出现问题： • 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 性 磷 酸 酶 将 载 体 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； DNA 5’ 端 去 磷 酸 • 插入片段可双向插入； 插入片段可双向插入 双向插入； 化，这样只有载体 • 插入片段可多拷贝插入。 插入片段可多拷贝插入 多拷贝插入。 和插入片段之间才 能发生连接； 能发生连接； DNA片段两端为 片段两端为非同源的粘性末端 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高， 可实现定向克隆，连接效率高，简捷
常用克隆载体
质粒 λ噬菌体 Cosmid 真核病毒 YAC, BAC
1、什么是质粒? 什么是质粒? 2、质粒作为基因工程载体的原因? 质粒作为基因工程载体的原因? 3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点? 质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?
松弛型* 独立复制，拷贝数高, 松弛型*－独立复制，拷贝数高 10-200个 个
修饰酶
Reverse Transcriptase 细菌碱性磷酸酶BAP 细菌碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶CIP 牛小肠碱性磷酸酶
Alkalinephosphatase
T4 Polymerase Kinase
载 体
载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩 载体(vector)是能够携带外源 进入宿主细胞进行扩
利 用 磷 酸 酶 防 止 载 体 DNA 的 重 新 环 化
质粒载体的定向克隆
。
基因工程常用工具酶 限制性内切酶
作
用
识别DNA特定序列，切割DNA链 特定序列，切割 识别 特定序列 链
DNA聚合酶 或大片段 1、切口平移制作标记 聚合酶I或大片段 、切口平移制作标记DNA探针；2、合成 探针； 、合成cDNA第二 聚合酶 探针 第二 Klenow fragment 条链；3、填补双链 凹端； 、 条链； 、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析 凹端 序列分析 DNA连接酶 连接酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶 逆转录酶 T4多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 S1核酸酶、绿豆核酸 核酸酶、 核酸酶 酶 DNA端酶 端酶I 端酶 RNA酶A 酶 磷酸酶 连接两个DNA分子或片断 分子或片断 连接两个 聚合酶链式反应（ 聚合酶链式反应（PCR） ） 合成cDNA第一条链 合成cDNA第一条链 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化， 催化多核苷酸 羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 羟基末端磷酸化 在3’ 末端加入同质多聚物尾 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端 降解单链 或 ，使双链 突出段变为平端 降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口 ，在双链 降解 上产生随机缺口 降解除RNA 降解除 切除核酸末端磷酸基
+ 检
工具酶
修饰酶 连接酶 限制性内切酶
DNA聚合酶 聚合酶 DNA Polymerase 逆转录酶 Reverse Transcriptase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase T4多核苷酸酶 多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase
限制性内切酶 活性定义
限制酶的一个活性单位（ ） 限制酶的一个活性单位（1U），原则 上是在50µl的反应液中，37℃的温 的反应液中， ℃ 上是在 的反应液中 度条件下，经过1小时反应，将 1µgDNA完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量
双元载体系统
克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体， DNA为目的的载体 克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常
分类
分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。 分子较小，自我复ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ能力强，拷贝数高。如 pBR322、pUC、M13等 pBR322、pUC、M13等。
表达载体： 表达载体：以获得基因表达产物为目的的载
体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数 通常要具有强启动子、结构稳定、 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。
第四章 分子生物学的研究方法
一、重组DNA技术 重组DNA DNA技术
1973年 以DNA重组实验成功为标志 年 重组实验成功为标志 遗传物质是DNA 遗传物质是 DNA双螺旋结构 双螺旋结构 遗传信息传递方式 工具酶 载体 转录酶
理论上三大发现 现代分子生物学 技术上三大发明
跨越天然物种屏障 定向创造新物种
λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 插入型载体：允许插入5-7kb的外 插入建 λgt 噬菌体载体。 噬菌体载体。
科斯质粒 (Cosmid)
粘粒、 粘粒、柯斯质粒 是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由 λDNA的COS区(约20-数百 数百bp)与质粒重组而 的 区 约 数百 与质粒重组而 成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复 但不表达任何噬菌体的功能。 制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆 40-50Kb的外源 的外源DNA片段。 片段。 的外源 片段
Ti质粒的功能组件： 质粒的功能组件： 质粒的功能组件
T-DNA
T-DNA特点： DNA特点： 特点 • 可自发转移，并整合进植物基因组； 可自发转移，并整合进植物基因组； • 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； • 长度 长度12-24Kb。 。
共整合载体系统
由Ti质粒衍生出的载体系统 质粒衍生出的载体系统
Ti 质粒
---天然载体系统 ---天然载体系统
土壤脓杆菌—植物病原菌— 质粒感染 质粒感染— 土壤脓杆菌—植物病原菌—Ti质粒感染—冠瘿瘤
基因导入
天然载体系统：土壤脓杆菌（ 质粒 质粒） 天然载体系统：土壤脓杆菌（Ti质粒） 发根脓杆菌（ 质粒 质粒） 发根脓杆菌（Ri质粒） 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工介导等
穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞 穿梭载体：带有两种复制原点，
和真核细胞中都能繁殖的载体， 和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真 核基因的克隆。 核基因的克隆。
克隆载体的特性
• • • • 复制起始： 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点： 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性， 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA DNA片段尽可能大 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大