第五章 细菌检验技术

目录一. 细菌检验的基本技术1.1无菌技术1.2细菌形态学检查方法1.3培养基1.4消毒灭菌二.日常检验工作涉及的项目2.1菌落总数2.2大肠菌群2.3金黄色葡萄球菌2.4沙门氏菌2.5大肠埃希氏菌2.6志贺氏菌三.生物安全基本知识3.1生物安全柜的使用3.2移液管和移液辅助器的使用3.3废弃物处理3.4感染性物质防护技术3.5微生物实验室容器破碎及感染性物质溢出的应急处理一. 细菌检验的基本技术1.1 无菌技术无菌：指物体上不存在活菌。

无菌操作：防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。

微生物检验样品的全部过程必须保证无菌操作，必须严格执行无菌操作技术，防止污染和病原菌的扩散。

在进行无菌操作时应注意以下要点：1.1.1进行接种、倾注琼脂平板等均须在无菌室或超净工作台内进行。

以防杂菌污染。

1.1.2无菌室在使用前，用紫外灯照射30min至1h或用5%石炭酸或5%来苏喷雾消毒。

1.1.3所用的物品均应在使用前严格进行灭菌，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触，如不慎碰着应立即更换无菌物品。

1.1.4 、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。

1.1.5 接种环（针）在每次使用前后，应在火焰上彻底烧灼灭菌。

1.1.6 应采用机械移液器。

禁止用口移液，注射器不能用于吸取液体。

1.1.7从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开瓶塞后及塞回前，管（瓶）口部应通过火焰1～2次，以杀死可能附着管口或瓶口的细菌。

开塞后的管口或瓶口应尽量靠近火焰，试管及烧瓶应尽量平放，切忌口部向上和长时间暴露于空气中。

1.2细菌形态学检查方法细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一。

它可用于细菌的分类与鉴定，并为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。

在我们检验中经常会遇到对所要鉴别的细菌进行染色。

细菌染色的基本程序是：涂片（干燥）→固定→染色（媒染）→（脱色）→（复染）常用的细菌染色法：单染色法复染色法：1．革兰染色法是细菌学中最经典、最常用的染色法之一。

《微生物学检验》教学大纲课程代码：00031025课程名称：微生物学检验课程总学时：136学时（其中理论68学时，实验68学时）课程类别：必修课课程性质：专业课面向专业：医学检验技术专业开设单位：基础教学部病原生物与免疫学教研室一、课程的性质、地位和任务《微生物学检验》是医学检验技术专业的一门专业课程。

本课程总论部分主要介绍微生物学及微生物学检验的基本知识，各论部分主要介绍常见病原微生物的生物学特性，包括形态染色特征、培养特性、生化反应特点、抗原性和分类，致病性和免疫性，微生物学检验的标本采集要求与方法、检验鉴定程序、具体的鉴定方法及鉴定要点和报告方式。

通过实验课程的学习，巩固和加强对微生物学及微生物学检验理论知识的认识和理解，提高学生的实际操作能力，培养学生创新思维和实事求是的科学态度。

二、课程教学目标（一）理论、知识方面1.明确微生物学检验的研究内容，学习微生物学检验的目的，认识医学微生物分类的意义及各类医学微生物的主要特性。

2.掌握医学微生物的主要生物学性状、遗传与变异机理、理化因素及生物因素对医学微生物的影响。

3.熟悉病原微生物的主要传播途径、致病性及免疫性。

学会对各类病原性微生物感染的常用实验室诊断方法。

4.明确病原微生物感染的特异性防治和药物治疗原则。

5.掌握常见的微生物所致疾病的临床症状和诊断指标6.了解对各类病原微生物的防治原则。

（二）能力、技能方面1.熟练掌握显微镜的使用和保养。

2.正确阐述常见的病原微生物的生物学性状，致病物质，主要传播途径及引起疾病的类型。

3.掌握常见的病原微生物感染的诊断方法。

4.将理论知识与具体的实验操作相结合，熟练掌握各种基本的医学微生物学诊断方法的机理，熟练各种基本实验的操作。

5.能运用学到的微生物学及微生物学检验专业知识，对各类临床标本进行病原微生物学的鉴定，及时地发出规范、准确的鉴定报告。

三、课程教学内容和要求第一篇微生物学检验基础绪论（1学时）1.教学内容及基本要求【教学内容】（1）微生物与微生物学（2）医学微生物学发展简史（3）微生物学及微生物学检验【基本要求】：掌握:微生物的定义与特点;微生物的分类。

细菌鉴定及检测方法
1、首先要获取被鉴菌种的纯培养菌落；
2、其次利用革兰染色或者抗酸染色确定其染色；
3、根据形态及其排列，按照科、属、类次序继续鉴定；
4、最后利用知识、经验等方法做出判断，得出结果，给出鉴定。

细菌鉴定方法：
1、生化鉴定：为细菌鉴定中最重要的一种鉴定手段，主要借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对致病菌进行鉴定，生化鉴定包括蛋白质分解产物实验、酶触实验、堂分解产物实验等等方法。

2、血清鉴定：一般用于含有较多血清型的细菌，常用玻片凝集试验，也可以用免疫荧光法、协同凝集实验、间接血凝试验等方法灵敏的检测样本中致病菌的特异性抗原。

用已知的抗体检测未知待检测的细菌，或者采用已知抗原检测患者血清中的抗细菌抗体的效价，特异性比较高，一般在生化鉴定基础之上给出确定诊断结果。

3、分子生物学检测：一般适用于人工培养基无法生长或者生长速度过于缓慢以及营养要求高不容易培养的细菌，检测方法含有核酸杂交、生物芯片以及基因测序等等；其中核酸杂交包括斑点杂交等等技术。

4、微生物自动鉴定系统鉴定
5、质谱技术：利用新兴的电力生物质谱对细菌核酸、蛋白质、堕胎等物质进行质谱分析。

细菌的一般检验方法
其次是显微镜观察，通过显微镜观察样本中的微生物形态特征，如细胞形状、大小、排列方式等，可以初步判断细菌的种类。

生化试验是另一种常用的细菌检验方法，通过检测细菌代谢产
物的生化反应，如呼吸、发酵、氧化等，来鉴定细菌种类。

此外，分子生物学方法也被广泛应用于细菌检验中，包括PCR （聚合酶链式反应）、DNA测序等技术，可以对细菌进行快速准确
的鉴定和分类。

除了以上方法，还有一些特殊的检验方法，如抗生素敏感性试验、免疫学检测等，用于评估细菌对抗生素的敏感性和进行免疫学
诊断。

总的来说，细菌的一般检验方法涵盖了培养、显微镜观察、生
化试验和分子生物学方法等多种技术手段，通过综合运用这些方法
可以对细菌进行准确的鉴定和分析。

一淀粉水解试验（一）实验原理细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。

胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。

这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。

水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。

（二）实验方法将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。

取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。

如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。

透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。

（三）实验试剂的配制肉汤蛋白胨琼脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

淀粉培养基制法：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，校正pH 值至7.6，分装三角瓶，121℃20min灭菌备用。

卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。

二糖发酵试验(一)实验原理单糖发酵是将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75-1％。

并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种细菌经37℃培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。

(二)实验材料1．菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2．培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。

(三)实验方法1．将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。