Vo.l29高等学校化学学报No.5 2008年5月C HEM I CAL J OURNAL OF C H I NESE UN I VERSI T I E S1065~1069新型壳聚糖基自组装纳米胶束紫杉醇药物释放载体王银松1,王玉玫1,李荣珊1,赵晶1,张其清2,3(1.天津医科大学药学院,天津300070;2.中国医学科学院、中国协和医科大学生物医学工程研究所,天津300192;3.厦门大学医学院生物医学工程研究中心,厦门361005)摘要以N2胆甾醇琥珀酰基2O2羧甲基壳聚糖(CC MC,胆甾醇基取代度619%)为原料,在水溶液中通过探头超声处理制备其自组装凝胶纳米胶束,采用稳态荧光探针法考察临界胶束浓度,并通过透射电镜和动态激光散射仪检测胶束的形态大小.以紫杉醇为模型药物,采用透析法制备载药CC M C纳米胶束,并通过高效液相色谱法(H PLC)考察其在纳米胶束中的包载及释放情况.结果显示,CC MC为两亲性高分子,在水溶液中能形成粒径为19814nm的规则球状胶束,临界胶束浓度为01018m g/mL.紫杉醇顺利包载于CC MC2纳米胶束内,载药量高达3419%;随着载药量的增加,胶束粒径呈增大的趋势.体外释放实验结果显示,CC MC 纳米胶束能延缓紫杉醇的释放,释药速度和释放介质p H值密切相关.关键词N2胆甾醇琥珀酰基2O2羧甲基壳聚糖;自组装纳米胶束;药物载体中图分类号O636.1;R944.1+5文献标识码A文章编号025120790(2008)0521065205两亲性聚合物能在水性介质中通过自组装方式形成粒径在纳米尺寸范围的胶束.该类胶束具有独特的核壳结构,在体内具有长循环、隐性和主体稳定等特点,并且由于聚合物的EPR效应(Enhanced Per meability and Retention E ff ect),能在肿瘤病变部位富集,实现对肿瘤组织的/被动靶向性0,用作抗肿瘤药物载体时能增加药物疗效,降低药物毒副作用[1].目前,聚合物纳米胶束的研究集中于合成嵌段共聚物[2,3],但从体内安全性的角度考虑,人们逐渐寄希望于以天然高分子材料为原料开发两亲性聚合物,制备自组装药物输送体系,其中疏水化改性多糖即为一个重要的研究方向[4,5].疏水改性多糖是指在多糖的亲水骨架中引入疏水基团,从而使其具有两亲性.在水性介质中,疏水改性多糖可通过分子内及分子间的疏水作用力组装形成多核结构的纳米胶束[6,7].多糖材料良好的生物相容性和可生物降解性使得该类纳米胶束在医药和生物技术领域有着广阔的应用空间,已成为研究的焦点.本课题组[7,8]合成了一种新型两亲性壳聚糖衍生物N2胆甾醇琥珀酰基2O2羧甲基壳聚糖(CC MC),制备了其自组装纳米胶束,并系统地研究了CC MC分子结构和纳米胶束形态、结构及功能之间的构效关系.研究发现,CC MC自组装纳米胶束对疏水小分子物质具有较高的包载能力,有望成为一种疏水药物的新型载体.本文以胆甾醇基取代度为619%的CC MC为原料制备纳米胶束,并以紫杉醇为疏水模拟药物,通过体外实验考察其在纳米胶束中的包载和释放情况,初步探讨将其用作疏水小分子药物载体的可行性.1实验部分1.1试剂与仪器CC MC(实验室自制,粘均分子量6178@104,羧甲基取代度70%,胆甾醇基取代度619%);紫杉醇(西安天诚医药生物工程有限公司);芘(Sig ma,用无水乙醇重结晶精制);甲醇和乙腈为色谱纯(天收稿日期:2007209207.基金项目:天津医科大学自然科学基金(批准号:2007KY08)资助.联系人简介:王银松,女,博士,讲师,主要从事高分子生物材料及药物制剂的研究.E2ma i:l wangy i nsong@tij m 1066高等学校化学学报Vo.l29津化学试剂研究所),其它试剂均为市售分析纯.Tecnai G2S T高分辨透射电镜(荷兰FE I公司);BI2200S M广角激光光散射仪(美国Brookhaven公司);F24500荧光分光光度计(H PLC,日本日立公司);LC210C高效液相色谱仪(日本岛津公司);UH2 500A超声波细胞破碎仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);透析膜(截留分子量12000~14000,美国).1.2两亲性考察及临界胶束浓度的检测采用稳态荧光探针法[7,9]考察CC MC的两亲性,并检测其在水溶液中的临界胶束浓度.1.3CCM C自组装纳米胶束的制备及药物的包载取一定量的CC MC分散于去离子水中,在37e,50r/m i n的条件下振荡48h,然后进行探头超声处理3m in(输出功率100W,间歇脉冲工作方式:脉冲宽度210s,间歇时间210s),重复操作至获得均一分散液,经滤膜(0145L m)过滤除去杂质,即得CC MC自组装纳米胶束.在超声条件下向空白胶束溶液中缓慢滴加紫杉醇甲醇溶液,置于透析袋内,于去离子水中透析处理8h,除去甲醇,即得负载紫杉醇的CC MC自组装纳米胶束.空白和载药CC MC自组装纳米胶束的粒径及其粒径分布采用动态光散射法(L LS,氩离子激光器),在25e,波长532n m,动态光散射角为90b的条件下检测;胶束的形态特征通过透射电镜进行观察.1.4载药纳米胶束包封率及载药量的测定参考文献[10]的方法,采用H PLC测定CC MC自组装纳米胶束中紫杉醇的含量.色谱条件:色谱柱为Lichrospher C18(416mm@150mm,5L m);流动相为甲醇2乙腈2水(体积比25B35B40);流速为1mL/m i n;柱温:30e;检测波长为227n m.包封率和载药量的计算公式如下:包封率=(胶束中的药物量/投药量)@100%;载药量=(胶束中的药物量/载药胶束总量)@100%1.5体外释放实验采用动态透析法[11]考察紫杉醇CC MC自组装纳米胶束在磷酸盐缓冲液(PBS,p H=410,712和910)中的释放特征.取2mL紫杉醇CC MC自组装纳米胶束分散液置于透析袋中,并于50mL透析介质中和(37?012)e,50r/m i n的条件下避光振荡,定时取015mL透析介质,按照H PLC法检测紫杉醇的含量,其释放百分率=(药物释放量/药物总量)@100%.2结果与讨论2.1CCM C的两亲性及其临界胶束浓度CC MC的分子结构如图1所示.62O H引入羧甲基基团改变了壳聚糖主链的刚性,增加了其亲水性,22N H2通过琥珀酰基的连接引入胆甾醇疏水改性基团,使其具有两亲性的分子结构.为了考察CC2 MC的两亲性和临界胶束浓度,采用稳态荧光探针法,以芘为荧光探针进行检测.芘是一种脂溶性荧光探针,在极性环境中的荧光极弱,而在非极性环境中的荧光很强.因此,当极性溶剂(如水溶液)中有疏水结构域生成时,芘分子自发由极性环境向非极性环境转移,造成荧光强度的增加.此外,芘的荧光发射光谱中,第一发射峰与第三发射峰强度比(I372/I385)和溶液的极性密切相关,称为芘/极性标尺0,随着溶液极性的增加,其比值也随之增大[9].本文利用芘的荧光强度以及I372/I385的变化来检测CC MC的两亲性及其在水性介质中的临界胶束浓度.F i g.1C he m ica l stru ctur e of cholester ol2m od if i ed O2car boxy l m ethyl ch itosan(CCM C)芘在CC MC 溶液中的荧光发射光谱如图2所示.随着CC MC 浓度的增加,芘的荧光发射强度呈明显增大的趋势,其中I 385比I 372的强度增加更为显著,这充分说明CC MC 在溶液中能形成具有疏水内核的胶束,荧光探针芘向这些疏水微环境自发转移的同时,其荧光发射光谱也产生了相应的改变. F ig .2 F luor escence e m issi on spec tr a of p yr en e(110@10-6m ol/L)i n C CM C solut i on w ith d iffer entconcentra t i on sc (CC MC)/(mg #mL -1):a .110;b .015;c .011;d .0105;e .01025;f .0101;g .01005;h .01001. F ig .3 Inten sity r a ti o(I 372/I 385)fro m exc ita tion spec 2tra of pyrene(110@10-6m ol/L )a s a function of concentra ti on of O 2ca r boxy m eth yl ch itosan (CM C S)and CCM Cv C MCS ;o CC MC .由I 372/I 385对lg c 作图(图3),当CC MC 在低浓度范围时,I 372/I 385约为118,与芘在水中的比值接近[12];当浓度逐渐增加时,I 372/I 385呈直线下降,说明CC MC 分子在水溶液中自发组装形成具有疏水内核的胶束,导致荧光探针芘逐渐由水介质向疏水微环境发生转移;I 372/I 385变化的转折点(两条直线的交点)所对应的浓度即为CC MC 的临界胶束浓度.计算得CC MC 在去离子水中的临界胶束浓度(c mc)为01018mg /mL ;此外,以O 2羧甲基壳聚糖(C MCS)作为对照的实验数据显示在浓度接近1mg /mL 时,I 372/I 385才开始有下降的趋势,说明在此浓度范围内,C MCS 难以自组装形成具有疏水内核的胶束.2.2 CCM C自组装纳米胶束的制备及其对紫杉醇的包载F ig .4 TEM i m ages(A 1,B 1)and the size d istr ibution s(A 2,B 2)of C CM C se lf 2a sse m b led nano m ice llesw ith out(A 1,A 2)and w ith(B 1,B 2)PTX load i n g i n th e d istilled wa terCC MC 在水性介质中通过探头超声处理,能形成均一分散的胶束溶液.如图4(A 1,A 2)所示,用透射电镜(TE M )观察到CC MC 自组装纳米胶束呈规则球状形态,表面光滑[图4(A 1)];动态激光散射法(LLS)检测其平均粒径为(19814?215)nm,分散系数为01278?0101[图4(A 2)].载药CC MC 纳米胶1067 No .5 王银松等:新型壳聚糖基自组装纳米胶束紫杉醇药物释放载体束的TE M 照片和LLS 检测数据如图4(B 1,B 2)所示.载药纳米胶束(紫杉醇载药量为3014%)与空白纳米胶束相比,粒径[(30513?718)nm]明显增大,粒径分布(01254?01079)变宽,球状形态变得稍微不规则,表面变得较为粗糙,但体系内几乎观察不到紫杉醇结晶的存在,说明紫杉醇完全物理包载于CC MC 纳米胶束内,这在体外释放实验中进一步得以证实.载药CC MC 纳米胶束在水溶液中较为稳定,在4e 条件下放置约28d 的时间,粒径无显著变化.载药CC MC 纳米胶束的性能参数见表1.载药量随着药物(紫杉醇)和载体(胶束)投料量比(药载比)的增加而增大(1817%~3419%);包封率在药载比1/5~1/3范围内无明显变化(9012%~9218%);当药载比升高至1/2时,包封率显著下降至6718%,说明CC MC 自组装纳米胶束对紫杉醇的负载已达到饱和.表1还显示载药CC MC 纳米胶束的平均粒径随着载药量的增加而增大(24516~35513nm).因此,从紫杉醇的载药量、包封率和纳米胶束的平均粒径三个方面综合考虑,可以确认1/3是制备载药纳米胶束的最佳药物/载体投料量比,故载药纳米胶束试验均按该投量比制备.Ta ble 1 C har ac ter istics of P TX 2loa ded CCM C self 2a sse m b led nano m icellesM ass rati o ofdrug /carrierDia m et er/nm Pol yd i spersity i ndex Load i ng con tent (%,m ass fracti on)Load i ng efficiency (%,m ass fracti on)1/524516?51801105?010531817?01579218?11601/427919?61501138?010172316?11059214?21571/330513?71801254?010793014?01509012?11451/235513?151601305?010593419?11656718?4155紫杉醇在水中的溶解度极低,现临床制剂中均是采用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(Cre mophor EL)和无水乙醇以体积比1B 1的混合溶液溶解后稀释给药,但患者可能产生严重的过敏反应、肾毒性及神经毒性等副反应[13].而紫杉醇包载于CC MC 自组装纳米胶束后,在水中的溶解度可高达017mg /mL ,提高了上百倍,可以通过水性介质直接给药,避免了使用Cre mophor EL 给人体所造成的毒害.2.3 体外释放实验采用动态透析法考察紫杉醇在CC MC 纳米胶束中的体外释放特征.但对于溶解性极差的药物而言,要真实地反映其体外释放行为,必须提供适当的漏槽条件[14].本实验中控制紫杉醇在释放介质中的最大浓度低于其溶解度,以致紫杉醇能在释放介质中形成一定的浓度梯度,较好地反映了其体外释F i g .5 PTX re lea se pr ofil es fro m PTX pr epa r a ti on s a t (37?012)e i n PBS sol u tions PTX 2Cre :PTX i n the veh icl e of Cre mophor EL /dehydrated alco 2ho;l PTX 2CC MC :PTX 2l oaded CC MC 2619self 2asse mb led nano m i cell es .放行为.紫杉醇在不同pH 的PBS 溶液中的释放曲线如图5所示.对照组(紫杉醇的Cre mophor EL /无水乙醇溶液,PTX 2Cre)中紫杉醇在PBS(p H =712)介质中释放迅速,12h 内的释放量高达8715%;而相同释放条件下,紫杉醇从CC MC 纳米胶束内的释放减慢,12h 内的释放量仅为3118%,84h 内的释放量为5913%,无突释现象,说明紫杉醇完全包载于CC 2MC 自组装纳米胶束内.此外,释放曲线还显示,紫杉醇在CC MC 纳米胶束中的释放速率和释放介质的p H 值密切相关.如在p H =712的PBS 溶液中释放较慢,而在p H =410或910的PBS 溶液中,释放速率有所增加.这主要是由于CC MC 分子中含有大量的游离)N H 2和)COO H (如图1),是一种新型高分子两性电解质,其等电点经浊度法[15]检测约为7114.因此,在偏酸或偏碱性溶液中,CC MC 分子中游离的)N H 2或)COO H 电离生成)N H +3或)COO -,而同种电荷间的相互排斥作用使得CC MC 自组装纳米胶束的凝胶网状结构充分吸水膨胀,对紫杉醇的通透性增加,造成释放速率的加快.这种释药机制在很多p H 敏感凝胶体系中均有报道[16,17],有利于抗肿瘤药物的靶向给药[18],降低对正常组织、器官的毒副作用.1068高等学校化学学报 Vo.l 29参 考 文 献[1] Torch ili n V.P..J .Contro.l Re.l [J],2001,73(2):137)172[2] N is h iya m a N.,Kataok a K ..N i ppon Geka G akkai Zass h i[J],2005,106(11):700)705[3] Kwon G.S .,Kataoka K ..A dv .Drug De.l Rev .[J],1995,16:295)309[4] Ak iyos h iK.,Suna m ot o J ..Supra m o.l Sc.i [J],1996,3:157)163[5] Wang Y .S .,Liu L .R .,Jiang Q .,et a l ..Eu r .Pol y m.J .[J],2007,43:43)51[6] Ak iyos h iK.,Deguch i S .,Taji m a H.,et al ..M acro m ol ecu l es[J ],1997,30:857)861[7] Wang Y .S .,Liu L .R .,Weng J .,et a l ..Carbohyd r .Pol y m.[J],2007,69:597)606[8] Wang Y .S .,Ji ang Q .,L i u L.R .,et a l ..Pol y m er[J],2007,48:4135)4142[9] K al yanas undara m K.,Thom as J .K..J .Am .Che m .Soc .[J ],1977,99:2039)2044[10] HUO M ei 2R ong(霍美蓉),Z HOU Jian 2P i ng(周建平),WE IY an(魏彦),eta l ..A cta Phar maceu tica S i n i ca(药学学报)[J],2006,41(9):867)872[11] WANG Y i n 2Song(王银松),HAN Yue 2L i an(韩月莲),L IY ing 2X i a(李英霞),et al ..Che m .J .Ch i n ese Un i versiti es(高等学校化学学报)[J],2007,28(6):1092)1097[12] Dong D .C .,W i nn i k M.A ..Can .J .Che m .[J],1984,62:2560)2565[13] On etto N.,Canett R .,W i nograd B .,et a l ..J .Nat.l Can cer .Inst .M onogr .[J ],1993,15:131)139[14] H an L.M.,Guo J .,Zhang L .J .,et a l ..Acta Phar m acologica Si n i ca[J],2006,27(6):747)753[15] LI J i 2H eng(李继珩),YU You 2W en(虞有文),YU Yan 2L i ng(于燕玲),et a l ..Ch i n .J .Bioche m.Phar m.(中国生化药物杂志)[J ],2000,4(21):175)177[16] Y ao K. 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E.,V ijayappa S .,K ozi n S ..Mo.l Cancer Ther .[J],2006,5(5):1275)1279C h itosan 2ba sed Self 2asse m b led Nano m icell es a s a NovelC a rr ier for PaclitaxelWANG Y i n 2Song 1*,WANG Yu 2M ei 1,LI Rong 2Shan 1,Z HAO Ji n g 1,Z HA NG Q i 2Q i n g2,3(1.College o f P harma cy ,Tianjin M e d ica l Uni ver sity ,T ianjin 300070,China;2.Instit u te o f B i o m e d ica l Eng i neering,Chi nese Acade my o f M edica l Science ,P eki ng Union M e d ica l College ,Tianjin 300192,Chi na;3.R esea rch Center o f B io m edica l Engineer i ng,M edica l School ,Xiam en Uni ver sity ,Xiam en 361005,China )Abstr act Self 2asse mbled nano m ice ll e s of N 2cholester ol succinyl O 2carboxy methyl chitosan (CC MC )were prepared by probe son ica ti o n method .The a mph i p h ilic property and t h e criticalm ice ll e concentration(c mc)of CC MC were deter m i n ed by fluorescence probe techn i q ue ;the mor phology and the size ofCC MC self 2asse mbled nano m ice lles were analyzed by trans m ission electron m icroscopy(TE M )and the dyna m ic laser light scattering (LLS).Pac litaxe l(PTX),bei n g used as model drug ,was entrapped into CC MC self 2asse mb led nano m ice lles by d i a lysis method .The drug load i n g and release properties were esti m ated by h i g h perf or m ance liquid chro 2matography(H PLC).The results sho w that CC MC was an a mph i p h ilic poly mer and f or m ed regularly spherica l nano m ice lles(m ean d ia m eter=19814nm )in aqueous medium by self 2asse mb l y ,and the c m c va l u e of CC MC was 0.018mg/mL .PTX 2loading CC MC self 2asse mb led nano m ice lles were successf ully prepared,w ith drug loadi n g content as h i g h as 3419%,and t h e ir mean d ia m eter i n creased w ith i n creasi n g the drug loading con 2ten.t PTX continuously re leased f ro m CC MC se lf 2asse mbled nano m icelles i n the re lease med ia of phosphate buff ered sa li n e(PBS)sol u ti o ns ,and its release was sensitive to the p H of the re lease media .K eyword s N 2Cholester ol succ i n yl O 2carboxyl m ethyl ch itosan ;Self 2asse mb led nano m ice lle ;Drug carrier(Ed .:H,J ,Z)1069No .5 王银松等:新型壳聚糖基自组装纳米胶束紫杉醇药物释放载体。
![一种自组装纳米载药胶束及其制备方法与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/d40e0e005b8102d276a20029bd64783e09127dcd.png)
![一种自组装纳米胶束、其制备方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/447b650c19e8b8f67d1cb9e0.png)
