目录1.概述2.验证范围3.验证目的4.验证参考文件5.验证小组名单6.验证小组职责7.验证内容8.结论与评价9.再验证周期1. 概述1.1. 本公司的洁净区分为A级、B级、C级和D级，拟定用于洁净区表面消毒的有三种消毒剂：75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、2%甲酚皂溶液。
本次验证方案将选用以上3种消毒剂分别进行验证试验。
1.2. 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期见下表：1.3. 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。
在利用消毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于5分钟。
1.4. 为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。
实验室考察部分，定量悬浮试验法适用于浸泡或液封方式的消毒方法；表面实验法适用于擦拭或喷洒方式的消毒方法。
洁净区设施表面材质有不锈钢、镀锌板及玻璃三种，故表面试验法选用不锈钢载片、镀锌板及玻璃载片模拟洁净区设施表面进行验证试验。
现场考察试验部分选择冻干车间的配液间（C级洁净区）、灌装间(A/B级洁净区)、灌装间操作人员手部消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。
1.5. A/B级洁净区使用的消毒剂需经0.22μm除菌过滤。
2. 验证范围本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。
3. 验证目的通过消毒剂消毒效果及有效期的确认，科学制订消毒程序，以保证各洁净级别的操作间及设备外表面、人员手部按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒防止污染的效果。
4. 验证参考文件《药品生产验证指南》（2003版）；《医疗机构消毒技术规范》（2012年版）；《中国药典》（2010年版）；《药品GMP指南-无菌药品》、《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》。
5. 验证小组名单6. 验证小组职责7. 验证内容7.1. 验证前参与实施验证的人员必须已经接受本方案的培训且考核合格。
见附表1。
7.2. 验证前准备7.2.1. 菌种7.2.1.1. 试验微生物以金黄色葡萄球菌作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；白色念珠菌作为致病性真菌的代表。
在上述规定的菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。
7.2.1.2. 75%乙醇、2%甲酚皂为中效消毒剂，0.1%新洁尔灭为低效消毒剂，均不具备杀灭细菌芽孢功能，根据上述内容，本次验证所用菌种见下表：7.2.1.3. 可接受标准：标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。
使用的标准菌种不能超过第五代。
7.2.1.4. 应确认菌种名称、来源、代数，见附表2。
7.2.2. 试剂及培养基7.2.2.1. 选用培养基见下表：7.2.2.2. 稀释液、冲洗液：0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
7.2.2.3. 可接受标准：所有试剂、培养基的规格、数量和保存条件满足要求，且在有效期内；脱水培养基呈流动粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。
7.2.2.4. 试剂/培养基检查确认记录见附表3。
7.3. 消毒剂配制：按《清洁剂、消毒剂的配制与使用标准操作程序》进行消毒剂配制。
7.4. 定量悬浮试验7.4.1. 目的：0.1%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液、2%甲酚皂溶液消毒效力的确认（定量悬浮试验法）。
7.4.2. 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24h即得，培养后微生物浓度应不少于105cfu/ml。
取白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于23～28℃培养24～48h即得，培养后微生物浓度应不少于105cfu/ml。
7.4.3. 将配制好的0.1%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液或2%甲酚皂溶液）按9ml/支分注于27支无菌具塞试管中，按照“5分钟组”、“10分钟组”和“15分钟组”共3组每组9支，进行分组编号。
7.4.4. 取供试菌液（105cfu /ml的金黄色葡萄球菌菌液，105cfu /ml的大肠埃希菌菌液，105cfu /ml的白色念珠菌菌液）1ml按照下表，分别接入到盛有9ml0.1%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液或2%甲酚皂溶液）的试管中（已进行10倍稀释），轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。
7.4.5. 试验方法分别在5分钟、10分钟和15分钟取接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过，然后各用0.9%无菌生理盐水50ml清洗滤膜，滤过，重复用50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共3次。
取下滤膜，含细菌的膜放入营养琼脂平板内，含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含菌膜面向上。
细菌于30-35℃的生化培养箱内培养3天，真菌于23-28℃的霉菌培养箱内培养5天。
培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。
7.4.6. 阳性对照分别将105cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液、105cfu/ml大肠埃希菌菌液、105cfu/ml的白色念珠菌菌液逐级稀释至浓度为10～100cfu/ml，取稀释菌液1ml于平皿中，倾注冷却至45℃营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于30-35℃的生化培养箱内培养3天，真菌于23-28℃的霉菌培养箱内培养5天。
培养结束后对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。
0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认记录见附表475%乙醇溶液消毒效力确认记录见附表52%甲酚皂溶液消毒效力确认记录见附表67.5. 表面实验7.5.1. 目的:由于75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液要通过擦拭消毒，故选用不锈钢载片及玻璃载片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。
7.5.2. 工作菌液制备同7.4.2.项下菌液制备。
7.5.3. 染菌不锈钢载片制备：将经灭菌的不锈钢载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为1×108~5×108CFU/ml的菌液0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。
滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。
每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片；染菌玻璃载片制备：因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。
进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mm×50mm），标注清晰。
菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。
7.5.4. 取样7.5.4.1. 试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5min、10min、15min，不锈钢载片、镀锌载片及玻璃载片每个作用时间分别制备2个。
作用结束后，用接触碟取样（接触碟规格：?55mm，取样面积为25cm2）。
取金黄色葡萄球菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取大肠埃希菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取样白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基接触碟。
接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触10秒左右，盖上碟盖。
7.5.4.2. 对照组：对照组的活菌浓度同工作菌液的制备。
阴性对照：用接触碟在已灭菌的载片上（未染菌片的载片）按压取样，操作同上。
每种载片及每种接触碟平行制备两份。
7.5.5. 培养：将取样金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的接触碟倒置于30～35℃培养3天计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于23～28℃培养5天计数计数。
7.5.6. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度?（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值?(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）7.5.7. 可接受标准：杀灭对数值?(KL)应不低于3个对数单位。
75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认（表面实验）见附表7。
7.6. 消毒效力现场考察试验7.6.1. 目的：确认消毒剂对相应设施的实际消毒效力。
7.6.2. 操作：生产车间岗位操作人员按照《洁净区操作间清洁标准操作程序》、《洁净区水池、地漏清洁标准操作程序》、《洁净区人员手部卫生清洁标准操作程序》、《洁净区清洁用具清洁标准操作程序》、《洁净区工作服清洁标准操作程序》进行清洁消毒。
分别选取如下试验现场：7.6.2.1. 冻干车间的配液间（C级洁净区）顶棚、墙面、地面、工作台面，地漏、水池；7.6.2.2. 冻干车间的灌装间(A/B级洁净区) 顶棚、墙面、地面、工作台面、设备表面；7.6.2.3. 冻干车间灌装间(A/B级洁净区)操作人员手部；7.6.2.4. 冻干车间B级洁净区的工作鞋、清洁布、拖布。
7.6.3. 取样检测7.6.3.1. 消毒15分钟后，由QC人员到试验现场，按照《冻干C线洁净区（室）表面微生物监测标准操作程序》进行洁净区表面微生物的取样检测；7.6.3.2. 用浸泡或液封方式（地漏、水池、工作鞋、洁净布、拖布）的采用无菌吸管取浸泡液或液封液1ml，于胰酪胨大豆琼脂培养基平板培养；7.6.3.3. 灌装间(A/B级洁净区)操作人员，采用75%乙醇进行手部消毒。
将配制好并经过0.22μm除菌过滤的75%乙醇盛装于喷壶中，灌装间操作人员在生产开始时进行手消毒，间隔5分钟、10分钟、15分钟、20分钟分别进行手指菌取样。
7.6.3.4. 连续逐日测定，共测定3次。
记录测定结果。
7.6.4. 可接受标准：所监测的洁净区的微生物均符合各自的洁净级别要求。
75%乙醇溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表80.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表92%甲酚皂溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表1075%乙醇用于手消毒效果实验记录见附表117.7. 消毒剂储存有效期确认试验7.7.1. 目的：通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会发生变化，符合要求。
7.7.2. 程序：7.7.2.1. 在进行消毒剂有效期确认时，每天开启装消毒剂的容器（具塞磨口玻璃瓶、手消毒器、消毒液喷壶）不少于3次，其每次开启时间在1~2分钟，以模拟实际操作的最差条件。
7.7.2.2.分别在消毒剂储存的第3天、第5天、第7天、第10天进行取样，进行消毒剂消毒效力的确认。
7.7.2.3. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度?（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值?(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）7.7.2.4. 可接受标准：在消毒液有效期末，杀灭对数值?(KL)应不低于3个对数单位。
消毒剂储存有效期确认记录见附表128. 结论与评价得出最终结论，并对此验证进行总评价。
