第三章 细胞工程

第三章细胞工程案例1. 世界上第一头克隆绵羊“多莉”1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多莉”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。

“多利”的产生与三只母羊有关。

一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。

芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。

其整个克隆过程简述如下：从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，图3-1 克隆羊“多利”使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。

出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。

从理论上讲，多莉继承了提供体细胞的那只芬兰多塞特母绵羊的遗传特征，它是一只白脸羊，而不是黑脸羊。

分子生物学的测定也表明，它与提供细胞核的那头羊，有完全相同的遗传物质（确切地说，是完全相同的细胞核遗传物质。

还有极少量的遗传物质存在于细胞质的线粒体中，遗传自提供卵母细胞的受体），它们就像是一对隔了6年的双胞胎。

克隆羊“多利”的诞生，引发了世界范围内关于动物克隆技术的热烈争论。

是科学界克隆成就的一大飞跃。

它还被美国《科学》杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项，也是当年最引人注目的国际新闻之一。

案例2. 植物人工种子的研制人工种子又称人造种子，这是细胞工程中较年轻的一项新兴技术。

人工种子在某种程度上可以替代天然种子，通过植物细胞培养技术生产大量的胚状体，仿天然种子结构而生产制成的。

人工种子由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成（如图3-2）。

最初是由英国科学家于1978年提出的。

他认为利用体细胞胚发生的特征，把它包埋在胶囊中，可以形成具有种子的性能并直接在田间播种。

人工种子技术有着诱人的前景，它具备以下特点：（1）它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，不受季节及气候的影响，且省地省工。

（2）在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，提高种子质量。

（3）用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高生产效率。

（4）对于自然条件下难以得到的种子的珍稀植物或基因工程植株，利用人工种子技术加速扩繁具有重要意义。

人工种子研制操作程序大致包括：外植体的选择和消毒；愈伤组织的诱导；体细胞胚的诱导；体细胞胚的同步化；体细胞胚的分选；体细胞胚的包裹(人工胚乳)；包裹外膜；发芽成苗试验；体细胞胚变异程度与农艺研究。

目前马铃薯、柑橘、胡萝卜、玉米、香蕉等都已顺利繁殖出了相应的人工种子。

上述案例介绍的只是细胞工程技术应用的个案，目前人们对动、植物细胞的认识仍然处于初级阶段，单就其组织培养而言，还有十分漫长的道路要走。

如即便像烟草和拟南芥这样的模式植物，也没能实现让它们在组培容器中遂愿生长发育和开花结实，因此细胞工程及其机制研究尚需深入研究。

细胞工程(cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。

广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。

根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程，微生物细胞工程归类为发酵工程范畴。

第一节细胞工程概述细胞工程是生物工程的一个重要方面。

总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。

按照需要改造的遗传物质的不同操作层次，可将细胞工程学分为染色体工程、染色体组工程、细胞质工程和细胞融合工程等几个方面。

一、细胞工程的内涵1.染色体工程染色体工程是按人们需要来添加或削减一种生物的染色体，或用别的生物的染色体来替换。

可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种。

动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法(如微细胞转移方法等)来达到转移基因的目的。

植物细胞染色体工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法来达到添加、消除或置换染色体的目的。

2.染色体组工程染色体组工程是整个改变染色体组数的技术。

自从1937年秋水仙素用于生物学后，多倍体的工作得到了迅速发展，例如得到四倍体小麦，八倍体小黑麦、三倍体西瓜等。

3.细胞质工程细胞质工程又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。

可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。

1981年瑞士学者伊梅恩斯等用灰鼠的细胞核注入到除去了精核的卵内，然后再将这个由黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵体外培养，形成胚胎后再移植到白色雌鼠的子宫里，经过二十一天的发育，得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。

这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。

4.细胞融合工程细胞融合工程是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。

细胞融合工程可用于产生新的物种或品系，如我们所熟悉的“西红柿马铃薯”、“拟南芥油菜”和“蘑菇白菜”等。

用这种体细胞融合的技术，如今已在动物间实现了小鼠和田鼠、小鼠和小鸡、甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。

虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。

细胞融合工程还广泛应用于单克隆抗体的生产。

单克隆抗体技术是利用克隆化的杂交瘤细胞（细胞融合所得）分泌高度纯一的单克隆抗体，具有很高的实用价值，在诊断和治疗病症方面有着广泛的应用前途。

二．细胞工程的研究历史植物细胞培养早在20世纪初即巳开始研究。

早在1902年，德国植物学家哈贝兰特依据细胞学说认为，高等植物的器官和组织可以分离成单个细胞，而每一个分离出来的细胞都具有进一步分裂和发育的能力。

为此，他还进行了高等植物离体细胞的培养，但未能成功。

1904年，亨宁(Henning)成功地进行了胡萝卜和辣菜根的离体胚培养。

我国学者李继同也进行了银杏胚的离体培养，发现了胚乳提取液能促进离体胚的生长。

1927年，温特(Went)发现了生长素吲哚乙酸（IAA)能促进细胞的生长。

到20世纪30年代，植物细胞培养研究取得了突破性进展。

人们发现，通过细胞或组织培养可使植物再生。

1934年，怀特（White)用番茄根建立了第一个无性繁殖系。

1939年，高特里特(Gautheret)、Nobercourt和怀特分别成功地培养了烟草、萝卜和杨树等细胞，并形成部分组织。

至此，植物细胞培养才真正开始。

随后，又相继发现了维生素和生长素等物质对植物细胞的生长发育有促进作用。

1955年，米勒(Miller)等学者发现激动素能促使培养细胞分裂，激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并确定了植物培养液控制芽和根形成的激动素/生长素的比例。

1956年，Roetier等首先申请了用植物细胞培养生产化学物质的专利。

从此，利用植物次生代谢生产药物的研究蓬勃发展起来。

到20世纪60年代，科金(Cocking)等建立了植物原生质体培养和融合技术。

20世纪70年代以后，外源基因片段可引入植物细胞体内，通过培养，这种细胞可获得人们所需的产物。

同时，大规模培养技术方面也取得了巨大发展，如日本开发了20 000L搅拌釜式反应器，用于烟草细胞的培养。

以后，植物细胞和组织培养在世界各地广泛展开和应用，各种细胞和组织培养技术也日益完善。

动物细胞工程起初应用于疫苗的生产。

在疫苗产业早期，利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛生产天花疫苗。

用某些细菌接种到动物身上生产抵抗该种细菌的疫苗。

1920一1950年，已经开发出多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黄热病疫苗等。

1951年，Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养液，这标志近代动物细胞培养技术的开端。

大规模培养动物细胞生产生物制品，始于20世纪50年代。

最初的生产方法是采用成千上万只体积小的培养瓶。

1967年，Van Wezel开发了适合贴壁细胞生长的微载体，使得动物细胞的培养能够在搅拌釜式反应器中进行，从而大大提高了生产率。

微载体培养系统现已得到广泛应用，最大可达15000L.规模。

在过去30多年的时间内，用动物细胞技术生产的疫苗挽救了几百万人和动物的生命。

三、细胞工程的发展前景1. 发展细胞工程具有战略意义细胞工程的战略意义是毋庸置疑的。

从利用转基因技术培育抗旱植物，改善我国生态环境，再造一个山川秀美的西北，到研制基因疫苗和基因药物，根治一些长期困扰我国人民群众的重大疾病；从食品、轻工、材料、环保，至刑事侦查、道德伦理，甚至包括国家安全(有报道称一些国家正在利用基因研究得到的人种差异结果，研制专门针对某类人种而对其他人种无害的生物武器)。

可以说细胞工程无处不在，前景不可估量。

细胞工程的产业化历程才20多年，还是一个新兴产业。

1977年，世界第一个含人生长素释放抑制因子的重组DNA在大肠杆菌中获得表达，在科学上标志着人工重组DNA体外表达的成功。

不久，第一家基因工程公司Genetech诞生。

1982年，该公司推出了第一个基因工程药物——重组人胰岛素，标志着细胞工程商业化的开始。

2. 细胞工程产品具有独特价值（1）对病人更安全动物细胞培养生产产品的优点之一是使用安全。

过去使用动物细胞培养生产的生物制品，经常发生过敏反应或病原体传染的事件。

例如，脊髓灰质炎疫苗可能被猿猴肾病毒污染；流感疫苗可能被引起过敏反应的鸡卵蛋白污染；使用从脑垂体提取的生长激素可能引起克雅病。

而用细胞工程生产的产品使用非常安全，能将致病因素降到最小，并可显著提高产品的质量。

因为动物细胞培养所用的细胞背景非常明确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。

（2）能保障蛋白质产品的产量和质量如果仅靠从自然界提取，许多生物蛋白制品也许不可能用于疾病的治疗。