020细胞工程-第二章 清洗与消毒

细胞工程复习提纲绪论名词：细胞工程：细胞工程是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。

第1章细胞培养的设施与基本条件1.细胞工程实验室的要求和基本设置（无菌，6方面工作）要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。

六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。

2.动植物细胞工程实验室的设置1. 动物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室无菌操作室是相对密封、防尘、防菌的工作空间。

理想的无菌操作室应划分为更衣间、缓冲间及操作间三部分。

(2) 培养与观察室(3) 制备室：在该区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。

(4) 储藏室(5) 清洗和灭菌室2. 植物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室(2) 培养室(3) 鉴定室(4) 清洗室(5) 灭菌室(6) 制备室(7) 驯化移植室3.常用设备1. 动物与植物细胞工程实验室通用的仪器设备(1) 超净工作台(2) 倒置显微镜(3) 电热干燥箱(4) 水纯化装置(5) 冰箱(6) 压力蒸汽消毒器(7) 细胞计数板和电子细胞计数仪(8) 过滤除菌装置(9) 离心机(10) 移液管和吸管(11) 离心管(12) 移液器(13) 天平2. 动物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 培养箱(2) 显微操作仪(3) 细胞融合仪(4) 细胞冷冻储存器(5) 培养用器皿(6) 手术器械3. 植物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 光照培养箱(2) 人工气候室(3) 摇床(4) 培养瓶第2章清洗与消毒1.玻璃器皿清洗步骤及要求一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。

清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。

2.常用的物理灭菌(1) 紫外线消毒紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其他方法进行消毒的器皿。

紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。

细胞培养用品的清洗与消毒v2.0一、清洗1、玻璃类流程：浸泡→刷洗和烘干→浸酸→冲洗要求：清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹，水滴不成股流下具体操作：新买：5%稀盐酸浸泡过夜1→自来水冲洗→洗洁精刷洗2→自来水冲洗（晾干或烘干50℃）→浸酸（一天一夜）3~4→自来水冲洗25遍→蒸馏水洗5次→双蒸水洗3次（或再用单蒸水冲洗5次）→干热灭菌（将温度升至150℃后关闭烘箱密闭3h，待冷却至常温）6→待使用已用：用后马上浸入洗洁精中浸泡一天7（带毒应浸入消毒水）→洗涤剂刷洗后自来水冲洗（晾干或烘干50℃）→浸酸（一天一夜）→自来水冲洗25遍→蒸馏水洗5次→双蒸水洗3次（或再用单蒸水冲洗5次）→干热灭菌（将温度升至150℃后关闭烘箱密闭3h，待冷却至常温）→待使用注意：1. 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等,用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质2.刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度3.清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。

浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面4.浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时5.最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干（或烘干）备用6.或高压蒸汽灭菌（湿热法），容器水分烘干→牛皮纸包内、报纸包外将容器口扎紧→121℃，30min高压灭菌→待使用7.用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面2、塑料类具体操作：新买：一次性无菌塑料制品打开包装即可使用已用：用后立即用流水冲洗→洗涤剂浸泡3小时后刷洗（用纱布或棉签）→自来水冲洗→5%稀盐酸浸泡过夜→双蒸水煮沸2~3次（10min/次）→包装烘干（50℃）→待使用3、橡胶类具体操作：新买/已用：用后立即用流水冲洗→洗涤剂浸泡3小时后刷洗（用纱布或棉签）→自来水冲洗→5%稀盐酸浸泡过夜→双蒸水煮沸2~3次（10min/次）→包装烘干（50℃）→待使用4、镊子、剪刀具体操作：洗涤剂刷洗→自来水冲洗5~6次→75%医用酒精浸泡3小时→酒精棉球1擦拭→待使用注意：1.酒精棉球应用双蒸水配置5、不锈钢除菌滤器具体操作：洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15min→蒸馏水冲洗2~3次（或浸泡24h）→三蒸水冲洗2~3次（或24小时）→干燥→备用6、金属滤网具体操作：自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗→干燥→备用二、消毒1.紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。

第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。

2）5B培养基其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。

3）White培养基其特点是无机盐数量较低，适于生根培养N培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

4）65）KM8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。

2、简要说明MS培养基的基本组成。

1）大量元素母液配制MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4•7H2O）和氯化钙（CaCl2,CaCl2•2H2O）五种化合物。

2）微量元素母液配制MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）。

3）铁盐母液配制MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO4•4H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2•EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。

4）有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。

5）激素母液配制MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？为了避免每次配制时都要称量各种化学药品，常常把培养中必需的一些化学药品，以10倍、50倍或100倍的量，配制成一种浓缩液，这种浓缩液被称为母液。

配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移去，而且还便于低温保藏。

确定培养基--按照扩大倍数称量--溶解--按顺序混合--定容--母液分装--贴标签--保存于冰箱。

大量元素应配成浓度为10倍的母液，--般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。

配置时化合物应分别称量，分别溶解;混合时注意先后顺序，防止产生沉淀;混合时要边搅拌边混合。

4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？（一）物理灭菌1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。

实验一清洗与灭菌[实验目的]能独立进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与灭菌，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法等操作技术，了解化学灭菌法的使用方法。

了解各种物理及化学消毒和灭菌的原理和适用范围。

为了维持细胞在体外长时间的生长繁殖，器具应严格洗净并用高压或干烤灭菌，对不能高压和干烤的培养液等，可用除菌漏斗过滤除菌。

维持细胞在体外生长的操作环境一般在无菌室(密闭、紫外线杀菌)进行；近年来多应用洁净工作台，借助空气过滤和高速吹风使细菌不能下落，也有两者结合使用的。

操作人员的手必须洗净和消毒。

为保证培养基的无菌条件，一般在培养基中加入青霉素100u∕mL、链霉素100μg∕mL。

也有人认为抗菌素具有毒性和抗药性而不加，这就需要更严格的无菌操作技术。

清洗与灭菌是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大的、最基本的步骤，也是其他组织培养实验成功的前提。

体外培养细胞对所使用的各种玻璃或塑料器皿的清洁和无菌要求程度很高。

细胞培养不好很多时候与清洗不彻底有关。

清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任伺物质。

一些有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。

无菌操作是保障细胞培养成功的关键因素，为此所用的全部器具必须保证无菌，操作过程不能带人任何细菌和其他微生物，这是维持细胞生存的基本条件。

灭菌与消毒在概念上是不同的，消毒只要求杀灭或清除环境中的致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病，或者说使其无害化。

灭菌不仅要求杀灭或清除致病微生物，还要求将包括非致病微生物在内的所有微生物全部杀灭或清除掉，这包括细菌、病毒、真菌、支原体和衣原体，也包括抵抗力极强的细菌芽孢等，以达到无菌的目的。

所以灭菌比消毒要求更高。

总之，消毒只要求场所与物品达到微生物很低密度的水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。

“灭菌”可以达到消毒的目的，但消毒不一定能达到灭菌的效果。

在细胞和组织培养工作中，灭菌与消毒分别应用于不同的场所和对象。

实验一、细胞实验简介及细胞培养常用器械的清洗与消毒
一、实验室的消毒灭菌与维护
1.窗帘拆下清洗晒干后挂上。

2.缓冲间和细胞间所有的仪器、设备表面里面均用抹布先擦干净后再用75%酒精擦拭。

3.细胞间往有灭菌锅的门缝用透明胶全部封口上。

4.缓冲间和细胞间地板用清洁剂擦洗干净后，再用消毒水擦两次。

5.缓冲间和细胞间开紫外灯半个小时。

6. 实验室日常管理：固定4个同学来做实验室管理人员，2人为1小组，轮流值班。

（1）每天用消毒水擦地板和实验桌面一次；
（2）开紫外灯半个小时；
（3）检查培养箱的温度、湿度、二氧化碳情况；
（4）协助老师准备实验。

二、培养用品的清洗、包装和灭菌按教材21页。

实验指导书课程：细胞工程讲课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培育基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的大体结构、必需的大体设备及其用途与作用方式，把握配制培育基母液的大体技术。

二、材料与用具：一、药品：生长调剂类物质、无机盐类、有机化合物等。

二、用具：分析天平、移液管、量筒、培育瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。

三、教学时数：4课时。

四、实验内容：（一）实验室的大体结构及要紧设备：一、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。

二、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培育基的消毒。

3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：寄存试剂及器皿。

4、预备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各类玻璃仪器、金属仪器等功能：培育基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处置；培育材料的观看分析。

五、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。

6、培育室：培育架、摇床等功能：培育物的操纵培育。

7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。

（二）培育基母液的配制：一、MS大体培育基母液：各成份单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：易与其他成份反映产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：二者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L①1mg/ml的6－BA 50ml：先用∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②ml的NAA 50ml：先用少量∕L的NaOH溶解后再加水定容。

注：精度要求精准到小数点后三位。

（三）培育器皿的洗涤：一、对污染的培育器皿先进行消毒灭菌处置；二、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，寄存于防尘橱内备用。

二、试剂标签：例：实验二 培育基的配制与灭菌一、实验目的：了解培育基灭菌的原理，熟悉培育基的组成和要求，把握固体培育基配制和灭菌的大体技术。

实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。

即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。

无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。

任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。

1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。

2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。

消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。

通常用化学方法来达到消毒的作用。

灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。

应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。

能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。

对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。

在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。

灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。

灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。

可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。

3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。

实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。

主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。

4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。