细胞工程第二章 细胞工程实验室组成及无菌操作技术-精选文档

第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。

2）5B培养基其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。

3）White培养基其特点是无机盐数量较低，适于生根培养N培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

4）65）KM8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。

2、简要说明MS培养基的基本组成。

1）大量元素母液配制MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4•7H2O）和氯化钙（CaCl2,CaCl2•2H2O）五种化合物。

2）微量元素母液配制MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）。

3）铁盐母液配制MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO4•4H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2•EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。

4）有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。

5）激素母液配制MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？为了避免每次配制时都要称量各种化学药品，常常把培养中必需的一些化学药品，以10倍、50倍或100倍的量，配制成一种浓缩液，这种浓缩液被称为母液。

配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移去，而且还便于低温保藏。

确定培养基--按照扩大倍数称量--溶解--按顺序混合--定容--母液分装--贴标签--保存于冰箱。

大量元素应配成浓度为10倍的母液，--般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。

配置时化合物应分别称量，分别溶解;混合时注意先后顺序，防止产生沉淀;混合时要边搅拌边混合。

4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？（一）物理灭菌1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。

指应用细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来对细胞的遗传表型进行定向改造，以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术.胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换,而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此各种性状均能保持其原来的优良特性.植物组织培养（PlantTissueCulture）：指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术.主要用于植物快速繁殖的组培技术plantcellCulture）：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖,获得大量细胞群体的一种技术。

plantCellTotipotency）：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息,在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力.分化：细胞后代在形态结构和功能上发生稳定性的差异的过程。

PlantCellDedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的植物细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程.再分化(redifferentiation):脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。

Callus）：植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增殖形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。

explant）：指将用于离体培养的各种植物材料,如器官、组织、细胞和原生质体等。

当继代培养时，将原培养物切割或不切割转移至新的培养基中的部分也称之为外植体。

第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术植物细胞培养基的组成成分1.无机化合物大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、Co、Mo2.有机化合物（1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3（烟酸）、VB9(叶酸)、肌醇以及维生素•C(抗坏血酸)等（2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等（3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等3.碳源和能源常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。

4.植物生长调节物质(Plant growth regulator)（1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等（2）细胞分裂素类(cytokinin)：促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分化，常用6-BA、KT、ZT等（3）赤霉素类:常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体发育成小植株（4）脱落酸（5）乙烯5.固化剂常用琼脂，一般用量为0.6～1.0％，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。

6.其他成分：活性炭、硝酸银、抗生素等动物细胞培养基的组成、常用培养基类型、常用溶液培养基的成分1.糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）2.氨基酸：12种必需氨基酸3.维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等4.无机盐类：大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。

细胞工程第1章细胞培养的设施与基本条件1、什么是细胞培养？细胞培养是最值培养的一种形式，所谓组织培养（tissue culture）习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。

其本意是指从活的机体中提取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。

2、细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离为单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单细胞层生长，或在培养液呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。

3、细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别：严格保持无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。

4、细胞工程实验室设计–原则防止微生物污染和有害因素影响–要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金隔板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧–清洗和消毒安置在另室5、细胞工程实验室核心部分：准备室、缓冲间、培养室6、细胞培养设备⏹CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

⏹使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

7、生物安全防护水平（BSL）由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平。

一级生物安全防护水平（BSL－1）：适合于非常熟悉的病源，不会经常引发健康成人疾病，对实验人员和环境潜在危险小。

一般也不使用特殊的遏制设备和设施。

二级生物安全防护水平（BSL－2）：适合于对人和环境有中度潜在危险的病源，应在生物安全柜中或其它物理遏制设备中进行。

三级生物安全防护水平（BSL－3）：该会引发严重的、可能致死的疾病的病源。

在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行，或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。