蛋白质分子基础5蛋白质一级结构测定
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一、实验目的1. 理解蛋白质结构测定的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质一级结构和三维结构的测定方法。
3. 了解蛋白质结构测定在生物学研究中的应用。
二、实验原理蛋白质是生命活动中的重要分子,其结构决定了其功能。
蛋白质结构测定是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
蛋白质结构测定主要包括一级结构测定和三维结构测定。
1. 蛋白质一级结构测定:蛋白质一级结构是指氨基酸的排列顺序。
测定蛋白质一级结构的方法有化学裂解法、蛋白酶水解法、高效液相色谱法等。
2. 蛋白质三维结构测定:蛋白质三维结构是指蛋白质分子在空间中的形态。
测定蛋白质三维结构的方法有X射线晶体衍射法、核磁共振法、冷冻电镜法等。
三、实验材料1. 蛋白质样品:人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)等。
2. 试剂:硫酸铵、氯化钠、丙酮、乙腈等。
3. 仪器:高效液相色谱仪、核磁共振仪、X射线晶体衍射仪、冷冻电镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质一级结构测定(1)将蛋白质样品进行化学裂解,得到多肽片段。
(2)使用高效液相色谱仪对多肽片段进行分离,得到单个多肽。
(3)对单个多肽进行质谱分析,得到氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定(1)将蛋白质样品进行X射线晶体衍射实验,得到蛋白质晶体。
(2)对蛋白质晶体进行X射线衍射,得到衍射图谱。
(3)根据衍射图谱,计算蛋白质分子的三维结构。
3. 蛋白质结构分析(1)使用核磁共振仪对蛋白质样品进行NMR实验,得到蛋白质分子的三维结构。
(2)将NMR实验结果与X射线晶体衍射结果进行对比,验证蛋白质结构。
五、实验结果与分析1. 蛋白质一级结构测定通过高效液相色谱仪和质谱分析,成功测定了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的氨基酸序列。
2. 蛋白质三维结构测定通过X射线晶体衍射实验,成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
3. 蛋白质结构分析通过NMR实验,成功得到了人血清白蛋白和牛血清白蛋白的三维结构。
与X射线晶体衍射结果进行对比,验证了蛋白质结构。
蛋白质一级结构测序原理
蛋白质一级结构测序是通过确定蛋白质中氨基酸的序列来确定其一级结构的方法。
有两种常用的方法用于蛋白质一级结构的测序:酶法和质谱法。
酶法是最常用的测定蛋白质一级结构的方法之一。
这种方法利用特定的酶将蛋白质分解成小片段,然后通过测定每个片段中氨基酸残基的类型和顺序来确定蛋白质的氨基酸序列。
其中,最常用的酶是胰蛋白酶和胃蛋白酶,它们在特定的条件下能够切割蛋白质中的肽键。
通过将蛋白质与这些酶反应,可以生成一系列的片段,这些片段之间存在特定的顺序关系。
接下来,通过分离和测定每个片段中的氨基酸数量和类型,可以推断出蛋白质的氨基酸序列。
质谱法是另一种常用的测定蛋白质一级结构的方法。
这种方法利用质谱仪对蛋白质进行分析,并测定其分子量和氨基酸成分。
在质谱仪中,蛋白质会被电离成荷质比之后进行分子量测定。
通过测量荷质比,可以推断蛋白质的氨基酸序列。
质谱法相比酶法的优势在于其速度更快且能够直接测定大分子量的蛋白质。
综上所述,蛋白质一级结构测序的原理主要包括酶法和质谱法。
通过分析蛋白质中氨基酸的序列,可以确定蛋白质的一级结构。
蛋白质一级结构测定详解蛋白质一级结构测定是指确定蛋白质分子中氨基酸的序列顺序。
蛋白质的一级结构决定了蛋白质的功能和特性,因此准确测定蛋白质的一级结构对于理解蛋白质的功能和研究蛋白质的生理机制非常重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质一级结构测定方法。
1.编码方法:蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学技术直接从DNA的序列中获取。
通过DNA的转录和翻译过程,蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学方法快速测定。
这种方法适用于已经测定过基因组的生物。
2.氨基酸分析法:氨基酸分析法是一种传统的蛋白质一级结构测定方法,通过将蛋白质水解成氨基酸,然后使用氨基酸分析仪来测定各种不同的氨基酸的含量和种类。
这种方法可以确定蛋白质中各种氨基酸的相对含量和比例,从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
3.编码二维电泳:编码二维电泳是一种结合二维凝胶电泳和质谱技术的方法,可以用来测定蛋白质的一级结构。
首先,将蛋白质进行酶解,然后使用不同标记的肽酶消化蛋白质样品,并通过二维凝胶电泳将消化产物分离。
然后,将二维凝胶电泳的凝胶切割成片段,使用质谱仪进行质谱分析。
最后,根据质谱分析的结果确定蛋白质的氨基酸序列。
4.氨基酸测序法:氨基酸测序法是一种直接测定蛋白质氨基酸序列的方法,通过测定蛋白质中氨基酸的顺序,可以确定蛋白质的一级结构。
氨基酸测序法通常使用肽酶来酶解蛋白质,并使用街染色物质标记氨基酸。
然后,通过比色法或质谱仪等方法测定每个氨基酸的相对含量或精确质量,最终确定蛋白质的氨基酸序列。
综上所述,蛋白质一级结构测定方法有很多种。
不同的方法适用于不同的实验目的和条件。
选择合适的方法来测定蛋白质一级结构非常重要,可以提供宝贵的信息来理解蛋白质的功能和特性。
随着技术的不断发展,蛋白质一级结构测定的准确性也在不断提高,相信将来会有更多的方法被开发出来来解析蛋白质的一级结构。
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构,指的是蛋白质分子中氨基酸的序列,其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义,对生命科学的发展更是起到了推进作用,而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于:①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备;②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据;③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段, 再对肽段进行氨基酸 序列测定,其中化学法裂解的肽段一般较大,适于自动序列分析仪测定;酶法的优点是专一 性强,降解后肽段易纯化,产率较高,副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序,测 定方法主要是化学法,酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典,它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率,使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱(LC)HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体,粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的,现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好,且用样量少,并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
百泰派克生物科技
蛋白质结构鉴定
蛋白质的分子结构分为四级,蛋白质结构鉴定指的是对蛋白质的这四级结构进行鉴定。
质谱可以用于蛋白质一级结构的鉴定。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质一级结构鉴定服务。
蛋白质结构
蛋白质结构是氨基酸链分子中原子的三维排列。
蛋白质是一种聚合物,特别是多肽是由氨基酸序列(聚合物的单体)形成的。
单个氨基酸单体也可以被称为残基,表示一个聚合物的重复单元。
蛋白质是由氨基酸经过缩合反应形成的,其中氨基酸在每个反应中损失一个水分子以便通过肽键相互连接。
为了能够发挥其生物学功能,蛋白质会折叠成一个或多个特定的空间构象,这些构象是由许多非共价相互作用驱动的,例如氢键,离子相互作用,范德华力和疏水堆积。
蛋白质结构鉴定
蛋白质的分子结构分为四级,其中一级结构指蛋白质多肽链中氨基酸的序列。
蛋白质的一级结构决定了其它高级结构,并定义了蛋白质的功能,因此鉴定蛋白质的一级结构是很重要的。
质谱法可以用于蛋白质一级结构的鉴定,即鉴定蛋白质的氨基酸序列。
为了了解蛋白质在分子水平上的功能,通常需要确定其三维结构,这是结构生物学领域范畴,可采用诸如X射线晶体学,NMR光谱,低温电子显微镜
(cryo-EM)和双偏振干涉法等技术来确定蛋白质的结构。
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目:N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白:用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥:氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法:过量的巯基乙醇处理,ph8-9室温,系统中放尿素和盐酸胍,烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇,巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成:完全水解酸水解:常用hcl,水解后除去碱水解:用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏,色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析:①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS:强烈荧光,灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽,在酸性有机溶剂中加热,N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶:肽链外切酶/外肽酶,从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶(水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大)C-末端分析:①肼解法:蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中,Gln,Asn,Cys被破坏不易测出,C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法:硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法:肽链外切酶,专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键,B只能释放精氨酸和赖氨酸,AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段:用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法:肽链内切酶。
胰蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法:测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段,对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤,也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括:
第一步:样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品,蛋白样品的质量越好,结果越准确。
常用的样品准备方法有:水解、沉淀、纯化和提取。
第二步:结构图谱分析。
在样品准备好之后,就可以进行结构图谱分析,以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有:X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步:原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后,就可以根据图谱分析的结果,构建蛋白质的原子模型,即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步:模型精度评估。
当构建完原子模型之后,就可以对模型进行精度评估,也就是把原子模型与实际情况进行比较,看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步:结构可视化。
在模型精度评估完成之后,就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化,使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步:结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后,就可以对蛋白质的原子结构进行分析,比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析,并对这一分析结果进行总结归纳,从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤,在蛋白质结构分析中,蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步,只有把这一步做对了,才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目:N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白:用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥:氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法:过量的巯基乙醇处理,ph8-9室温,系统中放尿素和盐酸胍,烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇,巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成:完全水解酸水解:常用hcl,水解后除去碱水解:用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏,色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析:①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS:强烈荧光,灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽,在酸性有机溶剂中加热,N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶:肽链外切酶/外肽酶,从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶(水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大)C-末端分析:①肼解法:蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中,Gln,Asn,Cys被破坏不易测出,C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法:硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法:肽链外切酶,专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键,B只能释放精氨酸和赖氨酸,AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段:用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法:肽链内切酶。
胰蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法:测定相对分子质量大的蛋白质序列。
一、蛋白质的一级结构(Primary structure)又称为共价结构或化学结构。
它是指蛋白质中的氨基酸依照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。
肽键:一个氨基酸的α-COOH 和相邻的另一个氨基酸的α-NH2脱水形成共价键。
1)组成肽链的氨基酸已残缺不全,称为氨基酸残基;2)肽链中的氨基酸的排列顺序,一样-NH2端开始,由N指向C,即多肽链有方向性,N端为头,C端为尾。
肽的颜色反映: 多肽可与多种化合物作用,产生不同的颜色反映。
这些显色反映,可用于多肽的定性或定量鉴定。
如黄色反映,是由硝酸与氨基酸的苯基(酪氨酸和苯丙氨酸)反映生成二硝基苯衍生物而显黄色。
多肽的双缩脲反映是多肽特有的颜色反映;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而取得的产物。
双缩脲能够与碱性硫酸铜作用,产生兰色的铜-双缩脲络合物,称为双缩脲反映。
含有两个以上肽键的多肽,具有与双缩脲相似的结构特点,也能发生双缩脲反映,生成紫红色或蓝紫色络合物。
这是多肽定量测定的重要反映.(二)天然活性肽1.谷胱甘肽(GSH):三肽(Glu-Cys-Gly),谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸普遍存在于生物细胞中,含有自由的-SH,具有很强的还原性,可作为体内重要的还原剂,爱惜某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化,使其处于活性状态。
2.促甲状腺素释放激素:三肽(焦谷氨酰组氨酰脯氨酸),可增进甲状腺素的释放。
3.短杆菌素S:环十肽,含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸,对革兰氏阴性细菌有破坏作用,要紧作用于细胞膜。
4.青霉素:含有D—半胱氨酸和D—缬氨酸的二肽衍生物。
要紧破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引发溶菌。
蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界限,一般是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量转变范围专门大, 从大约6000到1000000道尔顿乃至更大。
一、蛋白质的一级结构p1681. 概念—— 1969年,国际纯化学与应用化学委员会(IUPAC)规定:蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序,包括二硫键的位置。