第三章蛋白质一级结构的测定

蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。

很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。

5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。

常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。

反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。

羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。

Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。

胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。

蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。

它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。

蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。

首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。

常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。

第二步：结构图谱分析。

在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。

主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。

第三步：原子模型构建。

在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。

第四步：模型精度评估。

当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。

第五步：结构可视化。

在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。

第六步：结构分析和总结。

在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。

以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。

蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。

很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。

5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。

常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。

反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。

羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。

Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。

胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。

概述测定蛋白质一级结构的基本步骤蛋白质可是个神奇的东西呀！就像我们生活中的一个小秘密，要想揭开它的神秘面纱，了解它的一级结构，那可得一步步来。

首先呢，得把蛋白质从它所在的环境中分离出来，这就好比从一堆杂物中找出我们想要的宝贝。

然后，对它进行纯化，把那些杂质都去掉，让它变得纯净纯净的，就像把宝石打磨得亮晶晶的。

接下来，就是关键的一步啦，测定它的分子量。

这就好像要知道一个人的体重一样，得有个准数呀！可以用一些专门的方法，比如凝胶过滤或者质谱法啥的。

然后呢，把蛋白质切成小小的片段。

这就像是把一个大蛋糕切成小块，这样我们才能更好地研究它呀。

这一步可以用一些酶或者化学试剂来帮忙。

再之后呀，对这些小片段进行分析。

哎呀，就像我们仔细观察每一块小蛋糕，看看它们都有啥特点。

可以用各种方法，比如氨基酸分析呀，或者测序啥的。

最后呢，把这些小片段的信息整合起来，就像拼图一样，把它们拼成一个完整的画面。

这样，我们不就知道蛋白质的一级结构啦！
你想想看呀，这就好比我们要了解一个人的故事，得从他的点点滴滴开始拼凑，最后才能知道他完整的经历。

测定蛋白质一级结构不也是这样嘛！这可是个精细的活儿呢，需要我们耐心又细心地去做。

要是不这么一步步来，那可就像没头苍蝇一样乱撞啦，怎么能揭开蛋白质的神秘面纱呢？所以呀，这每一步都很重要，都不能马虎呢！我们得认真对待，才能真正了解蛋白质的奥秘呀！你说是不是这个理儿呢？
总之呀，测定蛋白质一级结构虽然有点复杂，但只要我们按照这些基本步骤来，一步一个脚印，就一定能成功的啦！让我们一起加油，去探索蛋白质的神奇世界吧！。

1.蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。

2.蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象（高级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)3.一级结构的要点．4.蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。

（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。

（3）测定多肽链的氨基酸组成。

（4）断裂链内二硫键。

（5）分析多肽链的N末端和C末端。

（6）多肽链部分裂解成肽段。

（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。

（9）确定多肽链中二硫键的位置。

5.蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。

6. 直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法 N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4B 法裂解 B1 B2 B3 B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。

7. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测600-800bp8. 测序前的准备工作9. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。

（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS —cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸10. 测定分子量用于估算氨基酸残基n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法11. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：⑴非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3Hβ巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 (α2β2)（注意，人的血红蛋白α和β的N 端相同。

）分子量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆二硫键： M 1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M 1 + 2M 212. 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。

蛋白质的结构可以分为四个层次来研究，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

其中一级结构又称蛋白质的化学结构（chemicalstructure）、共价结构或初级结构。

而二级结构、三级结构和四级结构又称为蛋白质的空间结构或三维结构(threedimensional structure)。

一、蛋白质的一级结构（一）蛋白质的一级结构所谓蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。

一级结构是蛋白质分子结构的基础，它包含了决定蛋白质分子所有结构层次构象的全部信息。

蛋白质一级结构研究的内容包括蛋白质的氨基酸组成、氨基酸排列顺序和二硫键的位置，肽链数目，末端氨基酸的种类等。

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的生物大分子，不同蛋白质的氨基酸种类、数量和排列顺序都不同，这是蛋白质生物学功能多样性的基础。

一级结构是蛋白质的共价键结合的全部情况，在生物化学及其相关领域中，许多问题都需要知道蛋白质的一级结构。

有些蛋白质不是简单的一条肽链，而是由2条以上肽链组成的，肽链之间通过二硫键连接起来，还有的在一条肽链内部形成二硫键（图2-7）。

二硫键在蛋白质分子中起着稳定空间结构的作用。

一般二硫键越多，蛋白质的结构越稳定。

蛋白质的氨基酸排列顺序对蛋白质的空间结构以及生物功能起着决定作用，通常氨基酸的排列顺序是不能轻易改变的，有的蛋白质分子只有—个氨基酸的改变就可能改变整个蛋白质分子的空间结构和功能，所以蛋白质的一级结构包含着决定其空间结构的因素。

（二）蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定就是测定蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，这是揭示生命本质，阐明结构与功能的关系，研究酶的活性中心和酶蛋白高级结构的基础，也是基因表达、克隆和核酸顺序分析的重要内容。

蛋白质一级结构的测定主要包括以下基本步骤：1．测定蛋白质的分子量和氨基酸组成获取一定量纯的蛋白质样品，测定其分子量。

将一部分样品完全水解，确定其氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。