大肠杆菌基因工程(2)
- 格式:ppt
- 大小:1.95 MB
- 文档页数:81
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株,有利于基因克隆,保存质粒,但该菌株的蛋白酶没有缺陷,表达的蛋白容易被降解,因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型:F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3)3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS ,Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77~81图文,阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81~83内容,掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习,我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后,下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选,获得大量的重组DNA分子,这就是外源基因的无性繁殖,即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后,在全部的受体细胞中,真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1.花粉管通道法(如图)(1)概念:是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞,借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验:利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理:授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a.提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA,配成质量分数为0.01%的溶液。
b.用棉线捆住将要在第二天开花的花朵,不让花朵自动开放。
c.第二天清晨给花朵进行人工授粉,授粉后套袋,作好标记。
基因工程5 2 3 4 16789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建细胞定位包涵体型异源蛋白的表达重组异源蛋白的细胞定位胞质型、周质型(内膜与外膜之间的空隙)和胞外型将重组异源蛋白引导至何种特定的细胞间隔各有利弊。
优选胞质,原因是在胞质型表达的表达水平高。
包涵体型异源蛋白的表达(胞质型)分泌型异源蛋白的表达(周质型或胞外型)融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建单独表达融合表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies ,IB )。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中,由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能,从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质,后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。
除此之外,包涵体中还含有少量的DNA 、RNA 和脂多糖等非蛋白分子。
包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点高效表达重组异源蛋白包涵体表达形式的优点:以包涵体形式表达的重组异源蛋白可达细菌蛋白总量的20%-60%。
具有固相特性,从而简化外源基因表达产物的分离纯化包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份,菌体经超声波裂解后,直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
基因工程课程习题选择题001 基因工程操作的三大基本元件是【A】I 供体II 受体III 载体IV 抗体V 配体AI + II + IIIBI + III + IVCII + III + IVDII + IV + VEIII + IV + V002 根据当今生命科学理论,基因工程的用途是【E】I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率A I + II + IIIB I + II + IVC I + III + IVD II + III + IVE I + II + III + IV003 根据基因工程的定义,下列各名词中不能替代基因工程的是【A】A基因诱变B分子克隆C DNA重组D遗传工程E基因无性繁殖004 基因工程的单元操作顺序是【B】A增,转,检,切,接B切,接,转,增,检C接,转,增,检,切D检,切,接,增,转E切,接,增,转,检005 下列有关基因的叙述,错误的是【A】A蛋白质是基因表达的唯一产物B基因是 DNA 链上具有编码功能的片段C基因也可以是 RNAD基因突变不一定导致其表达产物改变结构E基因具有方向性006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的,其生理意义是【D】A修复自身的遗传缺陷B促进自身的基因重组C强化自身的核酸代谢D提高自身的防御能力E补充自身的核苷酸消耗007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是【D】ABacillus amyloliquefaciensBEscherichia coliCHaemophilus influenzaeDProvidencia stuartiiEStreptomyces lividans008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起,其底物的关键基团是【D】A 2' -OH 和 5' -PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' -PD 3' -OH 和 5' -PE 5' -OH 和 3' -P009若载体 DNA 用 M 酶切开,则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中,能直接与载体拼接的是【D】M NA A/AGCTT T/TCGAAB C/CATGG ACATG/TC CCC/GGG G/GGCCCD G/GATCC A/GATCTE GAGCT/C G/AGCTC010下列有关质粒分子生物学的叙述,错误的是【B】A质粒是共价环状的双链 DNA 分子B天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列C质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制D松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增E质粒并非其宿主细胞生长所必需011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】A穿梭质粒B表达质粒C探针质粒D整合质粒E多拷贝质粒012 下列各常用载体的装载量排列顺序,正确的是【A】A Cosmid > λ-DNA > PlasmidBλ-DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >λ-DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid >λ-DNAEλ-DNA > Plasmid > Cosmid013 目前在高等动物基因工程中广泛使用的载体是【C】A质粒 DNAB噬菌体 DNAC病毒 DNAD线粒体 DNAE叶绿体 DNA014 若某质粒带有lacZ 标记基因,那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【D】A半乳糖B葡萄糖C蔗糖D5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基- b -D- 半乳糖苷(X-gal )E异丙基巯基- b - 半乳糖苷(IPTG )015质粒是基因工程中最常用的运载体,它的主要特点是【C】①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA ⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A ①③⑤⑦B ②④⑥C ①③⑥⑦D ②③⑥⑦016 双脱氧末端终止法测定DNA 序列是基于【A】ADNA 的聚合反应BDNA 的连接反应CDNA 的降解反应D特殊的DNA 连接酶E聚合单体2' 和5' 位的脱氧017 下列三种方法中,能有效区分重组子与非重组子的是【E】I 限制性酶切II PCR 扩增III 抗药性筛选AIBI + IICI + IIIDII + IIIEI + II + III018鸟枪法克隆目的基因的战略适用于【A】A原核细菌B酵母菌C丝状真菌D植物E人类019 cDNA 第一链合成所需的引物是【D】APoly ABPoly CCPoly GDPoly TE发夹结构020 Taq DNA 聚合酶的发现使得PCR 技术的广泛运用成为可能,这是因为【D】ATaq DNA 聚合酶能有效地变性基因扩增产物BTaq DNA 聚合酶催化的聚和反应不需要引物CTaq DNA 聚合酶具有极强的聚和活性DTaq DNA 聚合酶能使多轮扩增反应连续化ETaq DNA 聚合酶能使扩增反应在DNA 变性条件下进行021 为了利用PCR 技术扩增下列染色体DNA 片段上的虚线部分,应选用的引物顺序是【D】AI + IIBI + IIICI + IVDII + IIIEII + IV022 构建基因文库一般使用的载体是【E】I 质粒IIλ-DNA III CosmidAIBIICIIIDII + IIIEI + II + III023 强化基因转录的元件是【C】A密码子B复制子C启动子D内含子E外显子024 启动子的特征之一是【B】AGC 富积区BTATA BoxC转录起始位点D长度平均1 kbE含有某些稀有碱基025 下列基因调控元件中属于反式调控元件的是【A】A阻遏蛋白B启动子C操作子D终止子E增强子026包涵体是一种【E】A受体细胞中难溶于水的蛋白颗粒B大肠杆菌的亚细胞结构C噬菌体或病毒DNA 的体外包装颗粒D用于转化动物细胞的脂质体E外源基因表达产物的混合物027 外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是【E】I 融合基因能稳定扩增II 融合蛋白能抗蛋白酶的降解III 表达产物易于亲和层析分离AIIIBI + IICI + IIIDII + IIIEI + II + III028 第二代基因工程是指【C】A途径工程B代谢工程C蛋白质工程DRNA 基因工程E细胞器基因工程029 基因工程菌中重组质粒的丢失机制是【C】A重组质粒渗透至细胞外B重组质粒被细胞内核酸酶降解C重组质粒在细胞分裂时不均匀分配D重组质粒杀死受体细胞E重组质粒刺激受体细胞提高其通透性030利用毛细管作用原理,将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上并根据核酸杂交原理进行分析的技术是【D】AWestern 印迹转移技术BNorthern 印迹转移技术C基因的表现型分析法DSouthern 印迹转移技术031在翻译过程中.mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。
基因工程试卷及答案一、名词解释题1.同尾酶:许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的,且是对称的,即它们可以产生相同的黏性突出末端。
这些酶统称为同尾酶。
p222.星星活性:在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称为星星活性。
p263.基因克隆:通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接、插入适当载体,并导入受体细胞扩大形成大量子代分子的过程。
p394.基因文库:由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。
p395.包涵体蛋白:在一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起所形成的没有生物活性的、无膜裸露结构。
6.反义核酸:是指一些可以通过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合,抑制或封闭该基因的转录和表达,或切割mRNA使其丧失功能的人工合成的单链反义分子。
p3467.反义DNA::称反义寡核苷酸,是一种人工合成的、能与mRNA互补的、用于抑制翻译的短小反义核酸分子。
p3478.RNA干扰(RNAi):是指对应与某种mRNA的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)分子使mRNA发生特异性降解,导致其不能表达的转录后基因沉默现象。
p3509.限制性内切酶:是一种能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核苷酸酶。
p1510.基因治疗:是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织,通过替换或补偿引起疾病的基因,或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。
二、选择题1、DNA分子SexAI每隔多少个碱基会出现一个酶切位点(D )A、256B、1024C、4096D、163842、下列序列中认为哪一个最有可能是二类限制酶切位点(C )A、GAATCGB、GCTATGC、AAATTTD、AGGGGCA3、下列当A260/A280=(A )时,为纯DNA的是。
《基因工程》课程教学大纲课程名称:基因工程课程类别:专业主干课适用专业:生物技术考核方式:考试总学时、学分:32 学时 2 学分其中实验学时:0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习,使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路,了解基因工程技术的应用及发展趋势,为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科,要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、DNA连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术,了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度,在保证达到一定培养规格的前提下,考虑学生的接受能力和学习负担,同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接,防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点:基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、DNA连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点:目的基因的克隆、DNA连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主,要求教师认真备课,熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势,以合适的形式进行教学,提倡采用多媒体作为辅助教学手段;学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向,也可以阅读一些感兴趣的参考资料,训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述(1学时)1.教学内容(1)基因工程的概念;(2)基因工程的发展和历史;(3)基因工程的研究意义。
2.重、难点提示(1)重点:基因工程的概念;(2)难点:基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌,它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化,大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征,实现对其功能的改造和优化,从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种:1.转化(transformation):通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内,使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation):利用强电场将质粒DNA引入细胞内,使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction):使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer):利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中,外源基因导入之后需要进行表达和调控,以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中,启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节,以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域,大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因,大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白,并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如,利用大肠杆菌表达系统,可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如,通过改造大肠杆菌的基因组,使其具有降解有机污染物的能力,可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外,大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源,例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌是微生物中最为普遍的种类之一,其在生物工程研究中也扮演着重要角色。
大肠杆菌不仅因关系到人类营养和生态环境而广泛应用,而且由于其生长繁殖迅速,具有
良好的遗传性状以及可调控性强等特点,在基因工程中的应用也得到了越来越多的关注。
首先,大肠杆菌可以用于制备新型微生物色素。
由于大肠杆菌的膜蛋白性状和抗病毒
的质量,它们能够用于制造出自然结构完整的大肠杆菌色素。
这些色素能够用于抗肿瘤药
物的开发。
大肠杆菌色素可以被用来改变多种抗病毒活力,使它们更有效地抑制肿瘤细胞
的生长。
此外,大肠杆菌还可以用作基因表达系统。
它可以被用来做基因组挖掘和表达分析,这些工作为药物研发提供有价值的信息,例如新型药物的发现和开发,重组蛋白的制造和
功能的研究。
此外,大肠杆菌也可以被用作能够识别细菌毒素的选择性培养介质,从而检
测特定的病原体。
最后,大肠杆菌可以作为能够大量合成药物以及相关产品的“小工厂”,如重组植物
激素、抗生素和其他生物活性物质。
大肠杆菌是一种极具潜力的生物反应器,可以稳定生
产大量重要化学物质,并长期保持较高的性能质量。
此外,它还可以用作研究新颖的化学
过程的实验室,不仅可以证明一种化学反应是可行的,还可以利用实现它们的生物工程技
术来建立化学工厂,产生更大规模的产品。
综上,大肠杆菌具有良好的基因组可调控性,能够快速繁殖,形成色素,稳定表达,
能产生多种活性物质,检测病原体以及应用于研究新型化学过程等特性,这些特性都使得
大肠杆菌在基因工程中有着巨大的应用价值,使之成为一种普遍意义上重要的微生物细胞。
大肠杆菌在基因工程中的应用大肠杆菌是一种常见的细菌,因为其易于培养和遗传学特性而成为了基因工程的重要模型生物之一。
基因工程是人类利用分子遗传学、细胞生物学等技术手段对生物体进行基因改造的过程,使其实现某些人类所需的生物学功能。
本文将深入介绍大肠杆菌在基因工程中的应用。
一、大肠杆菌在DNA重组中的应用DNA重组是指将不同来源的DNA进行拼接、克隆或删除等操作来改变基因的结构和功能。
大肠杆菌是一种真正的工程菌,在DNA重组中有着重要的作用。
因为大肠杆菌的染色体只有一根,而且细胞的分裂时期只有30分钟左右,这就为大肠杆菌的DNA重组提供了非常便利的条件。
利用基因工程技术,可以将人类需要的目的基因克隆到大肠杆菌中,并利用大肠杆菌代谢途径的生物反应来合成所需要的特定蛋白。
此外,大肠杆菌也可以通过作为载体来传播适当的DNA。
大肠杆菌的细胞质中有着非常多的质粒,这些质粒可以独立于染色体进行复制和表达。
这意味着我们可以把重要的基因克隆到质粒上,利用大肠杆菌作为载体携带质粒将其引入真核细胞中。
这样,大肠杆菌及其质粒成为了一种高效的基因转移方法,为生命科学和生物技术中的基因治疗、基因诊断和疫苗等的研究带来了无限的可能性。
二、大肠杆菌在蛋白质表达中的应用大肠杆菌非常适合用于蛋白质表达,因为大肠杆菌具有快速繁殖、生长周期短和容易生长等优点。
在常规的重组蛋白制备过程中,研究人员常常使用大肠杆菌作为表达主机,将重组蛋白基因导入到大肠杆菌中,然后通过不同的表达条件来诱导基因表达,最终得到高含量且纯度较高的重组蛋白。
这项基因工程技术具有质量稳定、生产过程简单和成本低等优点,因此在医药生物领域的蛋白质药物和医用耗材领域受到广泛应用。
三、大肠杆菌在基因敲除中的应用基因敲除是一种通过人工手段消除某些基因表达功能的方法。
大肠杆菌是一种常见的基因敲除菌种。
利用基因敲除技术,研究人员可以选择性地删除大肠杆菌的某些基因,以了解这些基因在生物体代谢和生理过程中的功能,同时也能够根据需要对基因进行改造,以达到预期的效果。