Seahorse-XF实验流程
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虾青素试验方法警告----本产品对光敏感,在操作过程中应避光操作。
三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性,在操作过程中应注意避免与皮肤接触,如不慎接触到皮肤,应立即用清水冲洗。
本标准所用的试剂和水,除非另有说明,均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。
4.1 试剂和溶液4.1.1 三氯甲烷。
4.1.2 无水乙醇。
4.1.3 BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)。
4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液:称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得(现配现用)。
4.2 仪器和设备4.2.1 紫外-可见分光光度计。
4.2.2 分析天平。
4.2.3 超声波清洗器。
4.2.4 恒温水浴装置。
4.2.5 离心机(离心试管体积大于20ml)。
4.2.6 氮气吹干装置。
4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。
4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。
4.3 鉴别4.3.1 取试样约10mg于试管中,加50℃-60℃热水1ml,于50℃-60℃热水浴中超声5min。
冷至室温后,加入三氯甲烷(4.1.1)10ml并振摇30s,静置分层后,取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液(4.1.4)1ml反应,溶液应立即显蓝紫色。
4.3.2 取含量测定项(4.4.1)下的待测液,以三氯甲烷为空白,使用1cm的比色皿,于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱,其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间,光谱图参见附录A。
4.4 含量4.4.1 测定待测液:称取试样0.15g(精确至0.0002g),置于250ml棕色容量瓶中,加入BHT(4.1.3)约10mg,加入蒸馏水10ml,在50℃-60℃热水浴中超声5min,流水冷却至室温,加入无水乙醇(4.1.2)100ml和三氯甲烷100ml,于室温水浴中超声5min,用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。
取该溶液适量,置于具塞离心管中离心5min(转速为3000r/min),精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中,将容量瓶置于约45℃的水浴中,用氮气流吹干,用三氯甲烷溶解并稀释至刻度,摇匀,即为待测液,应立即测定(于20min内完成测定)。
glucose, L-glutamine, sodium pyruvate用于配制检测液,同时准备1N NaOH用于调pH值。
检测液配制方法见培训手册”Preparation of Assay Media for Use in XFp Assays”。
【注意】sodium pyruvate可以准备粉末,但我们更推荐购买sodium pyruvate 100mM 液体包装,使用方便。
注意购买后分装保存。
上述试剂配制都不需要无菌操作。
3.仪器和耗材:
无二氧化碳37度培养箱,pH计,细胞计数仪(或计数板),37度水浴锅,显微镜,
涡旋混合器,移液枪,0.22uM滤器,10ml灭菌管6个,1.5ml EP管若干。
【注意】请确认PH计是准确的好用的,提前使用校准液校准。
Seahorse实验要求精确测量PH值。
4.细胞:
我们曾经做过的效果比较好的细胞有C2C12,HepG2等。
请告知您实验室培养的细胞系有哪些,我们将采用贴壁牢的细胞进行培训及相关实验。
Seahorse问答集锦一次实验可以只使用探针板其中的一部分吗?为了将所有药物或化合物成功地注入细胞培养孔中,Agilent建议水化整个探针板并因需要将相同字母标注的全部加药孔注入药物(请参考实验流程中关于加载药物的注意事项)。
背景孔的加药孔也必须加上药物,保证所有的A加药孔体积一致,B、C、D孔同理,否则会造成打药失败;实验中为何必须设置背景校正孔?背景校正孔被用来过滤掉实验的干扰因素,比如温度和buffering capacity,这些干扰因素会影响氧含量和pH变化(非来源于代谢变化的影响)。
背景校正孔还能被用来修正整板间温度波动,来诊断潜在温度问题,以及作为实验获得非期望数据时原因筛查的切入点。
背景校正孔怎么设置?背景校正孔里除了没有细胞,其它所有操作和细胞孔一致。
96机型背景校正孔(A1,A12,H1,H12,即4个角)不接种细胞;24机型背景校正孔设置为(A1,B4,C3,D6);确保背景校正孔中只加入培养液(无细胞)为何细胞培养板需要在37℃无CO2培养箱中放置45-60min?细胞培养板在37℃无CO2培养箱(即普通37℃恒温培养箱)中孵育45-60min的目的是为了脱气,释放CO2。
Seahorse 实验时,我担心细胞量少,我多种点细胞可以吗?细胞的密度需要摸索,在实验上机前,长满板底面积80-90%为最佳,设置一个密度梯度,找到最佳的密度;细胞过密会使检测时形成的瞬间微室氧气快速耗尽。
Seahorse 实验,种细胞和平时种细胞有区别吗?安捷伦细胞培养板种细胞时候,枪头抵壁,与水平面呈45°角度加入,加完在超净台静置1小时,有助于促进细胞均匀分布并减少边缘效应。
96孔细胞板种80ul;24机型的板子分二步,先每孔接种100μL细胞悬液,培养细胞1-6小时,细胞贴壁后,再补充生长培养基,每孔加入150μL生长培养液,总体积为250μL。
加液时沿壁轻轻加入,避免吹起刚贴壁的细胞。
仪器的验收仪器的包装检查如果看到仪器包装箱上有明显的损伤,或者发货单上所列的箱子有丢失,收货方应在有效的交货文件上记下申诉意见。
如果在验收以后发现损伤或箱子丢失,那么收货方必须立即通知最后一位搬运货物的运输公司。
通知应以挂号信发出。
请务必在交货时记下任何损坏或丢失的物品,否则,保险索赔请求可能会被拒绝。
即使货物收货方通常不是投保人,他(她)也有义务记下任何损伤的疑点。
材料清单检查用户负责检查收到的材料是否与材料清单上所列相符。
卸货建议必须认真搬运仪器,否则可能会倾翻仪器,因此只有用叉车来升降仪器,即卸货和短距离运输都要将仪器置于叉车的托盘上。
叉车应避免突然起动。
尽量使仪器不要离开地面。
失去平衡造成的损坏完全不能赔偿。
仪器从一米高处掉下来将完全损坏。
不要让ARL9800 X射线荧光仪承受机械压力。
如果需要提升仪器,可使用仪器框架上的环。
在仪器运抵最终位置之前,别把仪器从木质托盘上取下来。
实验室准备仪器房间准备实验室布局下图示为实验室布局。
在仪器背面与墙之间至少留出30cm的距离,这是非常重要的。
因为冷却空气的出口位于仪器后面。
下图为带有12位样品库的ARL9900仪器布局。
注意:ARL9900 Oasis额外需要一台热交换器,以便通过空气来冷却X射线管水。
热交换器与仪器之间的地面距离可以小于10米。
如图所示,用户可以从左右侧抵达仪器各个部位,以便进行维护。
如果维护作业需要移动仪器,则使用托盘运输装置会很容易。
环境条件安装的仪器应防止强烈震动,避免阳光直晒,防尘和防止腐蚀性蒸汽或气体。
总之,对仪器房间的要求与一般工业控制房间的要求相同。
位置安装ARL9900最合适的位置是楼房底层靠阴面。
这些房间即使在夏季通常温度也比较低,因此能够容易地保持在一个合适的温度范围内。
位于靠阴面,说明不应使阳光透过窗户直晒在仪器上。
环境温度实验室理想的温度是22 °C 。
对于ARL9900 XP 型,室温与冷却水温相对应。
Seahorse XF实验流程(此为简略版实验流程,详细步骤参见培训手册)XF实验前一天1.种细胞:将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中,在生长培养基中过夜培养。
注:细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。
2.预热仪器:打开Seahorse仪器和电脑,并打开软件,使仪器升温至37℃,过夜预热。
3.水化探针:在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液,将测试板放回Utility Plate上,置于37℃无CO2培养箱中过夜水化探针。
XF实验当天1.准备检测液:用Seahorse XF Base Medium配制检测液,加入所需要的底物,将溶液加热至37℃,用NaOH调pH值至7.4,过滤,置37℃水浴中备用。
注:检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计,或者与生长培养基保持一致。
2.观察细胞:将细胞板从CO2培养箱中取出,在显微镜下观察细胞状态。
3.细胞换液:将生长培养基换为检测液,然后将细胞放置在37℃无CO2培养箱中1小时。
4.配药:根据试剂盒说明书,配制并稀释药物至所需浓度。
5.加药:将稀释好的药物分别加入测试板上的A,B,C,D 四个加药孔中。
注:根据实验设计选择所用加药孔数量。
6.设计实验模板:用软件记录实验条件和设计实验程序。
7.上机:开始运行实验程序,将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate一起放置到仪器托板上。
8.仪器自动校准探针。
9.换细胞板:当软件出现提示信息时,将Utility Plate换为细胞板。
10.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板,并在显微镜下观察细胞状态。
11.数据分析:采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。
Seahorse XF Pro是一款高端的代谷细胞分析仪,它采用了新颖的技术,可以实时监测细胞的代谢状态和功能。
Seahorse XF Pro的工作原理是基于代谷细胞的特异性代谷测定技术,它能够实时测定细胞内ATP产生速率和氧化磷酸化水平,从而揭示细胞的能量代谢和功能活性。
下面将逐步介绍Seahorse XF Pro的工作原理:1. 原理概述Seahorse XF Pro利用代谷细胞分析技术,通过测定细胞内ATP产生速率和氧化磷酸化水平来实时监测细胞的能量代谢和功能活性。
它采用了荧光探针技术和高通量检测系统,可以在短时间内对细胞进行多参数测定,为细胞代谷研究提供了重要的工具和技术支持。
2. 测定原理Seahorse XF Pro通过测定细胞内ATP产生速率和氧化磷酸化水平来实时监测细胞的代谢状态和功能活性。
它利用荧光探针技术,通过不同荧光信号的变化来反映细胞内代谷物质的浓度和动态变化。
Seahorse XF Pro采用了高通量检测系统,可以对多个样品进行同时测定,提高了测定效率和数据可靠性。
3. 适用范围Seahorse XF Pro主要应用于生物医学研究领域,可以用于细胞代谷、药物筛选、毒性评价和疾病模型研究等方面。
它可以对不同类型的细胞和生物样品进行分析,为科研人员和生物制药企业提供了一种快速、准确、可靠的细胞功能分析方法。
4. 工作流程Seahorse XF Pro的工作流程一般包括样品处理、实验设置、反应测定和数据分析四个步骤。
在样品处理阶段,需要对细胞进行适当的处理和预处理,以保证实验的准确性和可靠性。
在实验设置阶段,需要根据实验的要求进行合理的参数设置和实验方案设计。
在反应测定阶段,需要将样品加入到测定盘中,通过Seahorse XF Pro进行代谷测定实验。
在数据分析阶段,需要对测定结果进行分析和解读,得出实验结论和科研成果。
5. 应用前景Seahorse XF Pro作为一种新型的细胞分析仪器,具有广阔的应用前景和市场潜力。
目錄XF Assay Roadmap (3)1.確認海馬的使用機型 (4)2.購買正確的海馬耗材 (5)3.選擇您的加藥試驗 (6)a.Mito Stress Testb.Glycolysis Stress Testc.Fatty Acid Oxidationplex protein Activity & Substrate Utilization4.準備上樣用的細胞 (10)5.準備上樣用的培養基 (16)6.活化螢光探針組 (19)Day Before AssayDay of Assay7.更換上機用培養基 (20)8.準備上機用的藥物 (22)9.將藥物放置在注藥槽內 (25)10.上機與軟體操作 (27)1.確認您使用的海馬機型XFe24XFe96XFp2. 購買正確的海馬耗材FluxPak Series :內含細胞培養盤,螢光探針 & 校正液XF24:XF24 FluxPak XF96:XF96 FluxPak XFe24:XFe24 FluxPakXFe96:XFe96 FluxPakXFp :XFp FluxPakXFp FluxPaksXFpXF FluxPaksXF24 Islet FluxPak 適用XF24 & XFe24 only 分析活體組織與小型生物樣本 XFe96 Spheroid FluxPak適用XFe96 only 分析單一sphere 樣本3.選擇您的加藥試驗A.Mito Stress Test:完整評估粒線體功能的加藥測試Basal Respiration:粒線體於基礎狀態時的耗氧效率ATP Production:評估粒線體有多少氧氣參與產生ATPProton Leak:反應粒線體雙層膜的完整性,類似傳統的MMPMaximal Respiration:評估粒線體的極限運作效率Spare Capacity:評估粒線體所保留的潛力,也就是遇到變化可調整的彈性Non-Mito Respiration:粒線體以外的耗氧,若細胞內有許多ROS其值會增加對應藥物組:XF cell mito stress test kit適用XF24, XF96, XFe24 & XFe96XFp cell mito stress test kit適用XFp only皆內含Oligomycin, FCCP(須測試最佳濃度),Rotenone/Antimycin A(依使用方式, 可進行6~10盤實驗)B.Glycolysis Stress Test:評估糖解作用的極限運作能力Glycolysis:評估樣本從no glucose到瞬間glucose濃度飽和時的運作效率Glycolytic Capacity:評估當糖解作用為樣本唯一ATP來源時的運作效率Glycolytic Reserve:反應糖解作用代償粒線體能量缺口的狀況Non-glycolytic Acidification:分析糖解作用以外的產酸背景值對應藥物組:XF glycolysis stress test kit適用XF24, XF96, XFe24 & XFe96XFp glycolysis stress test kit適用XFp only皆內含glucose, oligomcycin & 2-DG(可進行6盤實驗)C.Fatty Acid Oxidation:評估脂肪代謝能力此實驗以Mito Stress Test為基礎,配合BSA-conjugated Palmitate和抑制劑etomoxir來評估細胞內源性脂肪代謝的比例, 以及可承受外來脂肪的代謝極限的程度是多少。
%1.引用标准《海洋监测规范第4部分:海水分析》GB 17378. 4-2007 19挥发酚的测定%1.检测项目海洋海水中的挥发酚%1.使用仪器分光光度计722N%1.检验方法4-氨基安替比林分光光度法19.2方法原理被蔗镭出的挥发酚类在pH 10.0±0.2和以铁氛化钾为氣化剂的溶液中,与4-氨基安替比林反应形成冇色的安替比林染料。
此染料的最大吸收波氏在510 nm处•颜色在30 min内稳定•用三氯甲烷萃取•町稳定4 h并能捉髙灵敏度•但最大吸收波长移至160 nnu本方法不能区別不同类甲丿的酚•而在毎份试样中各种粉类化介物的I'l分组成是不确定的・W此•不能提供含冇混合酚的通用标准参需物•本方法用苯酚作为参比标准.19.3试剂及其配制19. 3. 1无酚水:将普通蒸翔水放遥于全玻墙蒸18器中•加氢紙化钠至强敍性•滴入髙锈酸钾(KMn()J 溶液至深紫红色•放入少许无釉瓷片(浮石或玻璃毛细管亦可)•加热蒸氛弃去初惘份•收集无酚水干硬质玻璃瓶中•或于每升蒸憐水中加入0.2 g经280 C活化J h的活性碳粉末,充分振摇后用0. 45 pm 滤膜过滤。
19. 3.2磷酸溶液:用水稀释10 ml.磷酸(HsPO,p=l・69 g/mL)至100 mL.19. 3.3甲基橙指示液:2 g/Lo19. 3.4硫酸铜溶液(100 g/I・):称取10 g疏酸钢(CuSO<・5H2O)溶解于水中并稀释至100 mL. 19.3.5 三氯甲烷(CHC1Q或二氯甲烷(CH2C12).19.3.6精制苯酚:将苯»<GH$OH)a于50C〜70C热水浴中溶化,小心地移人100 mL^tg瓶中•用包有铝箔的软木室塞紧•氏中插右-支250C水银温度计•蒸惘瓶的支管与空气冷凝管连接•用一「燥的锥形饶瓶接受器•电炉加热蒸懾•弃去带色的液•收集182C〜18代溜份(无色)•密封避光保存.19. 3.7酚标准贮备溶液(1.00 mg /mL):称収1.000只梢制苯酚(见19. 3. 6)涪解于水屮•稀释至I 000 mL.通常宜接祢取精制的苯酚即町配标准溶液•若为非梢制苯酚可按下法标定:移取10.00 mL待标定的酚贮备溶液.注入250 ml.碘虽瓶中,加人5() ml,水.10. 00 n)L «酸盐涣化钾溶液(见19. 3.10)及5 mL盐酸(见19.3. 11)・立即盖紧瓶塞,摇匀。
目录Rohs检测流程及测试指引----------------------------------------------------第3页术语和定义电子电气产品中限用的六种物质的测定程序均质材料的定义电子产品的拆解电子产品测试的实践指引RoHS 指令豁免清单XRF 光谱筛选法介绍X射线萤光分析仪的有害物质分析----------------------------------------第30页什么是X射线电磁波的种类X射线的安全性什么是荧光X射线XRF测量原理X射线的统计波动萤光X射线分析仪器的构成荧光X射线分析仪的测量条件干扰波峰定性分析方法定量分析方法荧光X射线分析仪的测量条件关于塑料测定的补正结构用语说明SEA1000A台式荧光X射线分析仪器有害物质测定简易手册------第55页1.分析条件的区别使用2.分析线的设定3.测定上的注意点4.测定前的准备·结束5-1.根据常规程序进行样品测定的程序5-2.根据块体标准曲线进行样品测定的程序5-3.根据块体FP进行样品测定的程序6.装置的校正7.标准曲线的确认和更新8.管理值的登记和变更9.在常规测定程序下的波形保存10.在块体标准曲线程序下的能谱输入应用篇-实际样品测量及测定实例-----------------------------第64页RoHS对象元素的波峰的位置在实际样品测定中的注意点关于荧光X射线的测定实例容易混淆的波峰和区别方法简易拆分实例测定时的注意事项测量分析须知样品摆设方向的影响复合部品测量电线等的被覆材料的测量树脂部分的厚度厚的场合泡沫聚苯乙烯等的包装材料金属・塑料以外的样品测量基板・中间含有基板的样品无铅焊锡中的铅的测量涂饰・被镀的样品测定事例1-10XRF与其它检测仪器对电镀材料的分析差异S E A1000A仪器介绍----------------------------------------第83页仪器外观仪器校正及参考物质说明分析方法与材料种类对照XRF分析要素关于保险丝消耗品的更换方法故障检修特征X射线能量表R o h s检测流程及测试指引术语和定义电子电气产品中限用的六种物质的测定程序均质材料的定义电子产品的拆解电子产品测试的实践指引RoHS 指令豁免清单XRF 光谱筛选法介绍定义以下术语和定义用于整个文件,另外还有一些术语和定义可在试验过程的术语和定义部分找到。
Sea horse多功能生物能量代谢监测仪创新点:侦测技术的核心是将可以即时侦测培养环境中氧分子以及氢离子浓度变化的光学侦测器整合在可以活动的探针上。
在观测的过程中将探针贴近细胞,seahorse XF能量侦测仪可以及时观测细胞与周边培养环境交换分子的情况以了解代谢系统的变化,侦测完成之后探针会再离开细胞。
完全满足新世纪代谢侦测四不一没有的要求:不用额外的试剂、不会接触细胞,不破坏细胞结构,,易操控。
多功能生物能量代谢监测仪简介:1 世界上唯一一款无损伤实时同步侦测细胞糖酵解与线粒体功能的独步全球技术系统2 固态探针侦测技术:将可以即时侦测培养环境中之氧分子以及氢离子浓度变化的光学侦测器整合在可以活动的探针上。
在观测的过程中将探针贴近细胞,海马XF能量侦测仪可以及时观测细胞与周边培养环境交换分子的情况以了解代谢系统的变化,侦测完成之后探针会再离开细胞。
完全满足新世纪代谢侦测四不一没有的要求:不用额外的试剂、不会接触细胞,不破坏细胞结构,且没有学习门槛。
3 固态光纤传感技术:***灯激发,使用寿命长,独立24根光纤探针,便于单根探针损坏时更换,仪器维护成本低4荧光功能:高效LED光源,参考型光电二极管检测器及发射光电二极管探测器,减少光散射,提高检测数据的准确度5 检测方式:细胞种于专用24孔细胞培养板,细胞均一的贴在培养板的底部,检测过程自动形成7ul的半封闭环境,检测快速灵敏。
6 样品种类:悬浮细胞、贴附细胞、组织、分离的细胞器等7 质量保证:实时动态侦测,内设对照,真实反应细胞的生理状态,保证了实验的真实性。
8 仪器设计:整合式集成控制设计,全程触摸式操作,无杂乱的链接线,节省空间;人性化操作界面,易学易懂;与探针整合的4道自动加药槽,满足不同实验及不同领域的研究需求。
多功能生物能量代谢监测仪主要功能应用:1、Extracellular Acidification Rate (产酸率)糖酵解作用所产生的丙酮酸(pyruvate)经过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)反应产生乳酸(lactate),允许细胞在不消耗氧气的情况下快速产生ATP以满足能量需求,测量乳酸的氢离子可以说明无氧代谢的变化。
doi:10.11659/jjssx.08E021135·基础研究·利用SeahorseXF 96探讨不同细胞浓度和血清对线粒体功能的影响李晓栩1,崔 宇1,阳一栋1,周晓英1,矫 力1,王辰元1,杨诚忠1,史 诗2,黄 缄1 (1.陆军军医大学高原军事医学系/高原生理学与病理学教研室/极端环境医学教育部重点实验室/全军高原医学重点实验室,重庆400038;2.重庆医药高等专科学校生理教研室,重庆401331)[摘 要] 目的 利用SeahorseXF 96探讨不同细胞浓度和血清对HUVEC细胞和U87细胞线粒体功能的影响。
方法 利用细胞线粒体应激试剂盒,在不同浓度的HUVEC细胞和U87细胞中加入抑制剂(寡霉素、解偶联剂、鱼藤酮和抗霉素A),根据细胞浓度分为2000组、4000组、6000组和8000组,根据有无血清和不同的解偶联剂浓度分为血清+低解偶联剂组、血清+高解偶联剂组、无血清+低解偶联剂组和无血清+高解偶联剂组。
在SeahorseXF 96中测定线粒体的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),并比较HUVEC细胞和U87细胞各组线粒体的基础氧耗、质子漏、最大呼吸能力、非线粒体的氧耗、储备的呼吸能力、三磷酸腺苷(ATP)生成能力、线粒体呼吸潜力和偶联效率;比较HUVEC细胞和U87细胞之间上述指标的差异;观察血清和解偶联剂浓度对HUVEC细胞线粒体功能的影响。
结果 在HUVEC细胞和U87细胞中,2000组OCR显著低于4000组、6000组和8000组(P<0.01);2000组的ECAR显著低于4000组(P<0.01),4000组显著低于6000组和8000组(P<0.01)。
在HUVEC细胞中,与2000组比较,6000组和8000组的基础氧耗、储备的呼吸能力、ATP生成能力和最大呼吸能力增强(P<0.05),8000组非线粒体的氧耗和质子漏增强(P<0.05);在U87细胞中,与2000组比较,6000组和8000组的基础氧耗、非线粒体的氧耗和最大呼吸能力增强(P<0.05),8000组ATP生成能力、储备的呼吸能力和质子漏增强(P<0.05);HUVEC细胞和U87细胞各组间线粒体的偶联效率和线粒体呼吸潜力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
网络出版时间:2021-4-2717:02:00 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20210427.0851.002.html◇论 著◇低剂量乌头碱持续给药重塑hiPSCs CM线粒体能量代谢模式刘 泓1,2,岳兰昕2,邱丽珍3,肖成荣2,王淑美1,周 维2,高 月1,2(1.广东药科大学中药学院,广东广州 510006;2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850;3.天津中医药大学中医药研究院,天津 301617)收稿日期:2021-02-06,修回日期:2021-03-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(No8180140316,8163000131)作者简介:刘 泓(1994-),女,硕士生,研究方向:中药质量分析与评价,E mail:liuhong0754@163.com;高 月(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,研究方向:中药毒理,通讯作者,E mail:gaoyue@bmi.ac.cn;周 维(1989-),男,博士,助理研究员,研究方向:药物毒理学,通讯作者,E mail:zhouweisyl802@163.comdoi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.05.006文献标志码:A文章编号:1001-1978(2021)05-0617-07中国图书分类号:R 332;R284 1;R329 24;R329 411;R349 1;R452;R972摘要:目的 探究低剂量乌头碱对人诱导多能干细胞分化心肌细胞(humaninducedpluripotentstemcell derivedcardio myocytes,hiPSCs CM)代谢的影响。
方法 100nmol·L-1乌头碱对hiPSCs诱导分化的hiPSCs CM细胞持续给药后,能量代谢分析仪(Seahorse)检测代谢表型变化;微电极阵列(Microelectrodearray,MEA)检测电生理参数;qRT PCR检测脂糖代谢关键基因的表达;Westernblot检测hiPSCs CM中多能性转录因子的表达。
Seahorse XF实验流程
(此为简略版实验流程,详细步骤参见培训手册)
XF实验前一天
1.种细胞:将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中,在生长培养基中过夜培
养。
注:细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。
2.预热仪器:打开Seahorse仪器和电脑,并打开软件,使仪器升温至37℃,
过夜预热。
3.>
4.水化探针:在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液,将测试板放回
培养箱中过夜水化探针。
Utility Plate上,置于37℃无CO
2
XF实验当天
1.准备检测液:用Seahorse XF Base Medium配制检测液,加入所需要的底物,
将溶液加热至37℃,用NaOH调pH值至,过滤,置37℃水浴中备用。
注:检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计,或者与生长培养基保持一致。
2.】
3.观察细胞:将细胞板从CO2培养箱中取出,在显微镜下观察细胞状态。
培养箱4.细胞换液:将生长培养基换为检测液,然后将细胞放置在37℃无CO
2中1小时。
5.配药:根据试剂盒说明书,配制并稀释药物至所需浓度。
6.加药:将稀释好的药物分别加入测试板上的A,B,C,D 四个加药孔中。
注:根据实验设计选择所用加药孔数量。
7.\
8.设计实验模板:用软件记录实验条件和设计实验程序。
9.上机:开始运行实验程序,将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate
一起放置到仪器托板上。
10.仪器自动校准探针。
11.换细胞板:当软件出现提示信息时,将Utility Plate换为细胞板。
12.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板,并在显微镜下观察细胞
状态。
13.数据分析:采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。