应用胰蛋白酶裂解反相HPLC法分析rHuEPO肽图

RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化引言在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。

作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。

因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。

同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

仪器配置Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage色谱软件：Chromeleon 6.8测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：Time/min A/%B/%098240406040.1208045208045.198260982流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min检测器波长：214 nm进样量：20 µL柱温：35 ℃与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691,S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：Time/min A/%B/%C/D% -5.0782200.0782206030502060.108020650802065.1782207578220张婷婷金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司2流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep GasPressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。

聚合物分析测试—裂解色谱和反相色谱法裂解色谱（PGC）和反相色谱（IGC）由于高分子材料不能汽化，一般气相色谱不能直接测定高分子材料本身。

在普通气相色谱的进样部位加一个热裂解器，就成了裂解色谱。

裂解色谱是将高分子裂解成易挥发的较小分子，然后再将裂解产物进行气相色谱分析，从而来推断原样品的组成、结构和性质的分析方法。

科标分析以成熟的分析技术为理论依据，创建“光-色-热-质-元-化”联用的检测技术，在微量模块化方法学模拟技术中对产品的成分进行全方位的解析，科标分析聚合物分析测试服务，根据样品实际情况，制定专项检测方案，提供精准权威的检测数据。

常用的裂解器有：灯丝裂解器、管式炉裂解器、居里点裂解器和激光裂解器。

PGC在聚合物上的应用主要如下：（1）高聚物的直接鉴定，以整个谱图为“指纹图”；（2）共聚组成的分析；（3）鉴别共聚物和共混物；（4）高聚物链结构分析；（5）聚合物的热稳定性和热解机理研究。

在普通气相色谱中，固定相是已知的，被测的样品在流动相里。

反相色谱却相反，以被测的高分子为固定相，以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子（一般选择正构烷烃）。

IGC的测定方法与普通气相色谱相同，所不同的是IGC谱图只有一个峰，即一个保留体积。

测定随温度或流速的变化，可以研究高聚物的各种性质。

主要应用如下：（1）测定和。

结晶性高分子的IGC典型谱图见图11-5。

图11-5结晶性高分子的IGC谱图（2）结晶度的测定和结晶动力学研究；（3）齐聚物的分子量测定；（4）测定探针分子在聚合物中的扩散系数；（5）研究高分子溶液的热力学；（6）研究高分子的表面性质。

Q-TOF肽图分析步骤
Q-TOF（Quadrupole-Time of Flight）质谱仪是一种集四极杆和飞行时间质谱（TOF）两种技术于一身的质谱装置。

其结合了四极杆质谱的选择性离子传输和飞
行时间质谱的高分辨率、高精度测量能力，常用于肽的质谱分析，尤其是蛋白质鉴定和蛋白质组学研究中。

Q-TOF质谱对肽段的测定具有高质量精度和高解析度的特点。

图1。

Q-TOF肽图分析的基本步骤大致如下：
1、样品准备：
蛋白质提取：从生物样品中提取蛋白质。

蛋白质消化：使用酶（如胰蛋白酶）将蛋白质消化成肽段。

2、肽段分离：
HPLC：选择合适的色谱柱和梯度条件，通过高效液相色谱（HPLC）来分离混合肽段。

3、质谱分析：
肽段电离：在Q-TOF离子源中，肽段被电离并转化为气态离子。

母离子选择：四极杆选择特定的母离子进入碰撞单元。

碰撞诱导解离：母离子在碰撞单元被加能并解离生成子离子。

飞行时间分析：通过TOF分析器测量子离子的m/z值。

4、数据处理与分析：
肽段鉴定：通过配对肽段的碎片离子谱和预测的或数据库中的谱来鉴定肽段序列。

蛋白质鉴定：通过关联鉴定到的肽段来鉴定对应的蛋白质。

定量分析：如果进行定量实验，需要比较不同样本或条件下肽段的丰度变化。

生物信息学分析：深入挖掘蛋白质和修饰的生物学含义。

5、结果验证：
（1）核对鉴定出的蛋白质是否与实验背景和目的相符。

（2）对重要的蛋白质或肽段进行进一步的验证实验，如再次进行质谱分析或其他生物化学实验。

重组人白细胞介素211的胰蛋白酶切肽图分析饶春明3,张　翊,韩春梅,王军志(中国药品生物制品检定所生化室,北京100050)摘要:目的　建立标准肽图分析法,用于rhIL211的质量控制。

方法　应用Alliance HPLC系统及其温控自动进样器探索最佳胰蛋白酶切和色谱条件。

结果　连续3批rhIL211样品的RP2HPLC图谱完全一致,与rhIL211对照品比较,有20个峰与对照品吻合,但第6峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10峰之间多一个峰,说明rhIL2 11样品蛋白质结构与对照品比较存在细小差别。

这种差别经多肽片段分离和氨基酸序列测定证明是由于样品N端多2个氨基酸引起的。

结论　本法精确度高、重复性好、自动化程度高,可用于rhIL211的质量控制。

关键词:重组人白细胞介素211;肽图;Alliance HPLC系统;胰蛋白酶切中图分类号:R927 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2000)05-0378-03 重组人白细胞介素211(rh IL211)为血小板生长因子,可刺激造血干细胞和巨核细胞母细胞的增殖,并诱导巨核细胞的成熟,从而增加血小板的生成[1,2]。

由美国G enetic Institute(简称GI)研制的rh IL211为177个氨基酸,比天然成熟的人IL211在N端少一个氨基酸;成都地奥九泓制药厂生产的大肠杆菌表达的rh IL211为179个氨基酸,比天然成熟的人IL211在N端多一个氨基酸,目前已进入新药研究阶段。

肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有CNBr 裂解SDS2PA GE微量肽图法和胰蛋白酶切RP2 HPLC肽图法[3]。

本文用Alliance HPLC系统及其温控自动进样器摸索rh IL211肽图分析最佳胰蛋白酶切条件,在此条件下对成都地奥九泓制药厂生产的连续三批重组人白细胞介素211进行肽谱分析,并与GI公司研制的rhIL211比较,得到较好结果。

细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院陆渊指导老师郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCEC s）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。

实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。

通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。

建立一种细胞裂解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。

关键词：罗丹明123、BCECs、P-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract: The aim of this study is to figure out whether Itraconazole is an inhibitor of P-gp. To achieve this, we use brain capillary endothelial cells (BCECs) as a model and Rhodamine 123 as the substrate to evaluate the effect of Itraconzaole on P-gp. A sensitive and rapid high-performance liquid chromatography (HPLC) method with fluorometric detection after simple sample preparation procedure was developed for the determination of Rh123 in P-gp efflux studies. This method has been successfully applied to the qualification of Rhodamine123 in cell lysate obtained from P-gp efflux study conducted in brain capillary endothelial cells and can be employed for determination of the potential effect on P-gp.Keywords:Rhodamine 123, BCECs, P-gp, HPLC, Itraconazole, cell lysate前言伊曲康唑( Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小[1]。

蛋白质和多肽反相hplc分析和纯化指南Protein and peptide reverse phase HPLC analysis and purification guideline蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南Introduction:引言：Protein and peptide analysis and purification are essential steps in protein research and the pharmaceutical industry. Reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) is a widely used technique for separating, analyzing, and purifying proteins and peptides based on their hydrophobicity. This guideline aims to provide an overviewof the principles, methods, and best practices for RP-HPLC analysis and purification of proteins and peptides.蛋白质和多肽的分析与纯化是蛋白质研究和制药行业中的关键步骤。

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是一种基于蛋白质和多肽亲疏水性的广泛应用技术，用于蛋白质和多肽的分离、分析和纯化。

本指南旨在提供关于RP-HPLC分析与纯化蛋白质和多肽的原理、方法以及最佳实践的概述。

Principles of RP-HPLC:RP-HPLC原理：Reverse phase chromatography involves the separation of analytes based on their hydrophobicity using a hydrophobic stationary phase and a polar mobile phase. In RP-HPLC, a sample containing proteins or peptides is injected onto a column packed with a hydrophobic stationary phase such asC18. The polarity of the mobile phase, typically a mixture of water and an organic solvent, is gradually increased to elute the analytes. Proteins and peptides with higher hydrophobicity will have a higher tendency to interact with the hydrophobic stationary phase, resulting in delayed elution.反相色谱是利用亲疏水性质将待分析物分离的方法，其中使用了一个疏水固定相和一个极性流动相。

HPLC肽图分析HPLC肽图分析是一种常规鉴别试验，主要用于分析和鉴定由蛋白质酶切产生的肽片段。

基本原理是将蛋白质样本进行酶解，分解成多个肽段，然后通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行分离。

肽段通过色谱柱分离后采用UV检测器在波长200-230nm范围内（通常为214nm），记录色谱图。

最后将供试品的图谱与对照品的图谱进行比较，实现对目的肽段的精准鉴定和定量，最终用于产品放行实验中的鉴别试验、评价生产工艺的批间一致性和生产用细胞基质表达的稳定性。

反相高效液相色谱（RP-HPLC）法是一种分辨率高、检测灵敏度好的分析方法，可提供丰富的蛋白质和肽段信息，是蛋白质和肽段分析与表征的标准方法。

百泰派克生物科技BTP基于Waters公司的HPLC建立了肽图分析平台，具备完整的方法学开发、验证和检测能力，百泰派克生物科技通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证；为您提供一站式的HPLC肽图分析服务，欢迎免费咨询，了解更多详情！实验仪器• 高效液相色谱（紫外检测器）（2695/2996）。

案例示意蛋白酶解后的样品经过高效液相色谱的分离，紫外检测器采集数据，得到肽图结果，色谱图如下：图1 参比品的色谱图。

图2 样品的色谱图。

根据上述色谱图分析结果，可以发现样品中的肽图峰形和出峰时间与参考样品基本一致。

中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。

2. 相关的质谱参数（中英文）。

3. HPLC肽图分析详细信息。

4. 质谱图片。

5. 原始数据。

HPLC肽图分析一站式服务您只需下单-寄送样品。

百泰派克一站式服务完成：样品处理-上机分析-数据分析-项目报告。

作者简介:曾文珊,女,硕士研究生,副主任药师 Tel :(020)26282594 E -mail :zengwenshan @ 肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量控制中的应用曾文珊2,廖海明1,杨仲元2,徐康森1(1.中国药品生物制品检定所,北京100050;2.广州市药品检验所,广州510160)摘要:目的　通过肽图谱分析,鉴定重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性。

方法　采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法测定肽图;用LC -MS /MS 和N 端氨基酸测序鉴定产品氨基酸序列。

结果　建立重组人甲状旁腺素1-34产品肽图测定法,并鉴定出肽图异常产品的氨基酸序列。

结论　肽图分析能有效地控制重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性,对该产品的质量控制具有重要意义。

关键词:肽图谱分析;重组人甲状旁腺素1-34;胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法;液相色谱-质谱联用;氨基酸序列中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1001-2494(2006)13-1020-03Significance of Peptide Mapping in the Qu ality C ontrol of Recombinant Human Parathyriod Horm one 1-34ProductsZE NG Wen -shan 2,LIAO Hai -ming 1,YANG Zhong -yuan 2,XU Kang -sen 1(1.Natio nal Ins titute for the Control o f Phar maceutical and Biological Products ,Beijing 100050,China ;2.Guang zhou Institute for D ru g Co ntr ol ,Guang zhou 510160,China )ABSTRACT :OBJEC TIVE To identify the integrity and accuracy of the primary structure of Recombinant Human Parathyriod Hormone 1-34(rhPTH1-34)products by peptide mapp ing analysis .METHODS The peptide mapping was analyzed by trypsin digestion and RP -HPLC analysis .The amino acid seq uences of product were measured by LC -MS /MS and N -terminal sequence determination .RESULTS The pep -tide mapping analysis of rhPTH1-34products was establis hed .The amino acid sequences of rhPTH1-34product with a different peptide mappin g were measured .C ONCLUSION The peptide mappin g anal ysis can be used for the control of the integrity and accuracy of the primary struc -ture of rhPTH1-34products effectivel y .It has an important significance for the quality control of the products .KEY WORDS :peptide mapping analysis ;rhPTH1-34;trypsin digestion and RP -HPLC anal y s is ;LC -MS /MS ;amino acid sequences 肽图谱(peptide mapping )分析系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质,采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性,它作为基因重组药物一级结构确证及质量控制的重要组成部分已用于许多重组DNA 产品的质量控制[1-4]。

第一章多肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。

RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。

仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离，如图1所示的胰岛素变异物的分离。

胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。

特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！RP-HPLC对相近胰岛素变异物的分离图 1.RP-HPLC分离含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。

色谱柱：VYDAC 214TP54 洗脱液：27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。

科学文献中已有很多用RP-HPLC分离相似多肽的例子。

含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样生长因子与其未氧化态类似物已得到分离，白细胞介素-2突变蛋白也已经得到分离。

在最近的论文中，Kunitani及其同事提出，RP-HPLC的保留时间能提供保留在反相表面的蛋白质的结构信息。

他们研究了30种白细胞介素-2 突变蛋白，并分离了几乎相同的突变蛋白。

含氧化蛋氨酸的白介素与其自然状态得到分离，另外，单个氨基酸取代基也被与其自然状态分离。

他们得出结论：蛋白质的结构在反相分离中非常重要，同时，RP-HPLC也能用来研究蛋白质的结构。

在该过程中，他们展示了RP-HPLC技术对相似多肽的分离能力。

RP-HPLC用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。

制备RP-HPLC常常用于纯化克及毫克量的合成肽。

RP-HPLC能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚基和细胞功能。

RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。

常州工程职业技术学院毕业设计报告（论文）（ 2009 届）系别：制药与生物工程技术系课题名称：利用反相高效液相色谱分析和制备多肽指导教师：郝志芳班级：化学制药0611班学生姓名：刘骏摘要随着现代生物技术的发展,出现了各种多肽类药物,多肽在临床医学中有巨大的应用价值。

自从发明固相法化学合成多肽以来,有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展[1] ,但产物成分比较复杂,一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物,因此,对其分离纯化的最优化研究就显得格外重要。

此外,提供高纯度的多肽样品,对于其物化性质、生物活性及其医药功能的研究具有重要的作用。

从现代分离科学理论得出,色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。

电泳仅能用于分离而不能用于多肽的制备[2 ~4]。

反相高效液相色谱(RP-HPLC) 具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点,在多肽的分离纯化和制备中备受青睐,因此,RP-HPLC是目前分离纯化和制备多肽的主要手段[4~9] 。

本文拟用RP-HPLC对化学固相合成的多肽进行分离和制备。

关键词：多肽；反相高效液相色谱；分离；制备As the development of modern biological technology, many peptide medicines have been invented and produced. In the field of the clinical medicine, the peptide holds the massive value. Since the invention of the solid phase synthesis, chemical synthesis related a great number of activated peptide has skyrocket advancement [1]. However, the production contains certain impurities which have the similar structure as contrast the target peptide, therefore, it is important that the optimization research of the purification. And then, high purity peptide also can help the research of the physical and chemical character, biological activity and medicament function.We can conclude that the chromatography and electrophoresis are the best isolation effect methods at present.Nevertheless, the electrophoresis only use the qualitative experiments not preparation [2 ~4]. RP-HPLC holds high isolation, resolution and recycle ratio. As the upward reasons, RP-HPLC is the major method of the peptide purification in this world[4~9].Key W ords: Peptide; RP-HPLC; Separation; Preparation1前言与文献综述 (1)1.1 HPLC简介 (1)1.1.1HP LC起源 (1)1.1.2H P LC发展 (2)1.1.3HP L C前景 (3)1.1.4HP L C原理 (4)1.1.5R P-H P L C的应用与优点 (5)1.2多肽的简介 (6)1.2.1 多肽的合成方法 (6)1.2.2多肽的应用 (7)2多肽的纯化实验 (10)2.1仪器以及用具 (10)2.2试剂 (10)2.3实验方案 (10)3结果与讨论 (12)3.1粗肽的RP-HP LC分析 (12)3.2粗肽的RP-HP LC制备 (13)3.3ES I-MS以及纯品纯度的鉴定 (14)4结论 (17)致谢 (18)参考文献 (19)第一章前言及文献综述1.1色谱法(LC)、高效液相色谱(HPLC)以及反相高效液相色谱(RP-HPLC)的简介色谱法又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。

细胞因子原液肽图分析（胰蛋白酶裂解法）标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于细胞因子原液的检定。

目的：对细胞因子原液进行肽图分析。

原理：因胰蛋白酶能选择地水解蛋白质中由赖氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基所构成的肽链，所以用胰蛋白酶将目的蛋白水解成各特异肽段，用反相柱在乙腈的梯度洗脱条件下将各肽段加以分离鉴定。

内容：1 材料1．1样品：经二人核对批号后测定。

1．2试剂TRCK处理的胰蛋白酶（sigma）；碳酸氢铵 NH4HCO3分析纯三氟乙酸 CF3COOH 分析纯乙腈 CH3CH2CN 色谱纯冰乙酸 CH3COOH 分析纯1．3对照品: 由中国药品生物制品检定所提供。

1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1．5其它材料0.2ml进样器、硫酸纸、吸球。

1．6仪器、设备反向HPLC：C8或C18色谱柱Waten™486紫外-可见检测器680梯度控制器Waters 510型高压液相色谱泵电脑打印机扭力天平，TN100B型1．7器皿量筒1000ml、500ml、200ml；玻璃瓶500ml、1000ml；胶栓；三角瓶1000ml；以上均由本室洗刷组处理干净。

2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。

2．1．2调试仪器设备反向HPLC：C8或C18色谱柱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

Waten™486紫外-可见光检测器，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

680梯度控制器，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

Waters 510型高压液相色谱泵，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

电脑打印机，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

2．1．3配液2．1．3．1 1%碳酸氢铵，1000ml用扭力天平准确称取10克NH4HCO3，加注射用水至1000ml，注入1000ml三角瓶中，套上牛皮纸帽，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，室温放置。

肽图分析：揭示生物药物特征与品质的关键工具与方法生物药物是一类重要的治疗性蛋白质，其质量和完整性对其疗效和安全性至关重要。

了解生物药物的特征和质量是药物研发和生产的核心任务。

肽图分析作为一种重要的质谱技术，为我们提供了评估蛋白质序列完整性和质量一致性的关键工具。

一、肽图分析的原理和意义。

1.肽图谱的定义：肽图谱是通过质谱技术对蛋白质样品进行鉴定和定量分析，得到的蛋白质中酶切产生的肽段的分析图谱。

2.肽段覆盖率的意义：肽段覆盖率是评估蛋白质序列完整性和质量一致性的重要指标，对药物研发和生产具有关键意义。

二、肽图分析的关键步骤和技术。

1.样品制备：从生物药物样品中提取肽段样品，并进行预处理步骤，如还原、酶切等。

2.质谱分析：使用质谱技术对肽段样品进行分析，包括液相色谱质谱联用（LC-MS）、飞行时间质谱（TOF-MS）等。

3.数据解析与分析：通过数据库搜索算法和肽段鉴定工具，对质谱数据进行解析和分析，计算肽段覆盖率。

三、肽图分析在生物制药领域的应用和重要性。

1.特征评估：肽图分析可以评估生物药物的序列完整性、质量一致性和变异性，确保药物的质量和效力。

2.品质控制：肽图分析可用于生产过程中的品质控制，确保生物药物的一致性和稳定性。

3.药物研发：肽图分析可以帮助药物研发人员优化药物候选物的选择，评估药物与蛋白质相互作用的影响。

肽图分析作为一种重要的质谱技术，为我们评估生物药物特征和品质提供了关键工具与方法。

通过肽段覆盖率的分析，可以了解蛋白质序列的完整性和质量一致性，为药物研发和生产提供指导。

在生物制药领域，肽图分析的应用不仅可以提高药物质量，还能加速药物研发过程。

随着技术的进一步发展，肽图分析将在生物制药领域中发挥更重要的作用。

图1。

图2。

RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化引言在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。

作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。

因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。

同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

仪器配置Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage色谱软件：Chromeleon 6.8测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：Time/min A/%B/%098240406040.1208045208045.198260982流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min检测器波长：214 nm进样量：20 µL柱温：35 ℃与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691,S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：Time/min A/%B/%C/D% -5.0782200.0782206030502060.108020650802065.1782207578220张婷婷金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司2流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep GasPressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。

还原肽图样品处理（HPLC/UPLC/MAS）(1)将样品用超纯水稀释到4-5g/L，涡旋混匀，然后用6M盐酸胍，0.1mol/L Tris,Ph8.3溶液或6M盐酸胍，0.1M碳酸氢铵（AMBIC）(pH约为8.0)将样品稀释至2mg/ml,涡旋混匀。

（盐酸胍终浓度3-3.8M）(2)取稀释好的样品500ml于EP管中，加入0.5MDTT溶液5ml，涡流混匀，37℃水浴锅中水浴1.5-2.5h。

（DTT终浓度5mM）(3)水浴完成后加入0.5M IAM溶液13ul，室温避光反应45min。

（IAM终浓度为13mM）(4)取烷基化后的样品400ul加入到3KDa超滤离心管中，4℃，12000rpm，离心99min。

(5)离心完成后，在超滤管中加入0.1M碳酸氢铵溶液150ul，4℃，12000rpm，离心60min。

(6)离心完成后，将过滤部分反转于新的外管中，4℃，4000rpm，离心3min。

(7)用0.1M碳酸氢铵溶液洗膜，每次用180ul，洗两次，每次都将洗液转移到外管中。

(8)将上一步中的样品用移液枪轻轻吹打混匀，取100ul于EP管中，加入1ul0.1M氯化钙溶液。

（氯化钙终浓度1mM）(9)再加入胰酶溶液8ul，涡流混匀几秒钟，将样品置于37℃水浴锅中水浴酶切5、15h；（胰酶：蛋白-1:50）(10)酶解结束后，立即用1%FA样品=1:1体积比混合，终止反应。

（FA终浓度0.5%）pH<5(11)10000rpm,低温离心5min，取上清液为后续分析样品。

Note：1）实验步骤中离心99min和离心60min后，超滤管中的剩余液体的体积在20ul-40ul左右，过多或过少都可能是膜出了问题。

2）实验过程中每一步水浴都要将EP管用封口膜封好，以免EP管中进入其他液体。

3）使用完毕的超滤管要用纯净水洗净，用20%的酒精保存。

备注：非还原（也可考虑Ides切）：变性1:20切12h后终止，一针进样（低：1-3ug；高：10ug）。

肽图法在生物药品分析中的应用■肽图法在生物药品分析中的应用 AS/LC-002c 生物药品是指运用重组DNA技术或细胞培养技术生产的蛋白质类药品,其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。

关于其试验方法和评价方法,已经提出数种方针和准则。

此次,我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“肽图法”。

肽图法是旨在进行蛋白质的特性解析、同一性或稳定性的评价、变异检测的方法。

为了对多个出现肽峰的LC色谱图的洗脱模式进行比较,良好的峰保留时间和峰面积的重现性将成为非常重要的因素。

在此,我们以BSA和作为生物药品代表的抗体药物 IgG作为模型样品,使用LC测定其消化物,并对重现性进行了评价。

◆肽图法简介◆将蛋白质利用化学方法或酶进行消化,使用LC等仪器分离并检测生成的肽断片,通过比较其色谱模式,确认构成蛋白质的氨基酸的变化。

*肽图法是根据三大药典USP、EP、JP,在共同协商的基础上规定的试验方法,收录于JP日本药典第16版的参考信息中。

蛋白质肽蛋白酶HPLC分析UV检测■BSA 牛血清白蛋白消化物的测定例1 0 0 0 .01000<色谱条件>色谱柱 :LaChrom C18 5 μm4.6 mm I.D. × 250 mm 58 0 0 .0 3 4流动相 :A 0.1 % TFA / H Ov/v800221B 0.1 % TFA / CH CNv/v3 * 梯度流速 :1.0 mL/min6 0 0 .0600柱温 :40 ℃检测波长:UV 215 nm进样量 :10 μL4 0 0 .0400* 使用动态混合器<样品配制>2 0 0 .0200样品BSA ←添加相当于BSA重量1/100的胰蛋白酶反应 37 ℃、16 hr0 .0热处理 90 ℃、10 min0 .0 1 0 .0 2 0 .0 3 0 .0 4 0 .0 5 0 .0分离心分离10,000 rpm、10min、 3 ℃***********min将上清液作为进样样品■峰保留时间及峰面积重现性 n6【保留时间】峰No. 1 2 3 4 5Average 13.579 23.998 30.508 34.488 44.911 SD 0.009 0.012 0.012 0.018 0.012% RSD 0.06 0.05 0.04 0.05 0.03【峰面积】峰No. 1 2 3 4 5Average 313951 477180 729175 922057 814068SD 6957 11499 17599 22397 21035% RSD 2.22 2.41 2.41 2.43 2.58反复测定6次,峰保留时间的重现性%RSD在0.06%以下,峰面积重现性%RSD 在 2.6%以下,获得了良好的重现性。

附录肽图检查法本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。

第一法胰蛋白酶裂解 反相高效液相色谱法照高效液相色谱法（附录ⅢB）测定。

色谱条件用蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，供试品保存温度为4℃±0.5℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速为每分钟1ml，梯度洗脱70分钟(A液从100%至30%，B液从0至70%)，检测波长为214nm。

检查法取供试品溶液及对照品溶液（均为每1ml中含1mg的溶液，如供试品和对照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度），分别用1%碳酸氢铵溶液充分透析，按1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液［取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每1ml中含0.1mg的溶液］到供试品溶液与对照品溶液中，在37℃保温24小时后，按1∶10加入50%醋酸溶液，以每分钟10000转离心5分钟（或用0.45μm滤膜滤过），精密量取上清液100μl（或用0.45μm滤膜滤过），分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。

将供试品溶液与对照品溶液的图谱进行比较，即得。

第二法溴化氰裂解法检查法取供试品与对照品适量（约相当于蛋白质50μg），用水透析16小时，冷冻干燥，加溴化氰裂解液［取溴化氰0.3g，加甲酸（70→100）1ml使溶解］20μl溶解，室温放置24小时，裂解物加水180μl，再冷冻干燥。

冻干的裂解物用水复溶至适当浓度。

照SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法（附录ⅣC）（胶浓度20%）进行电泳，用银染法染色。

将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。

附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法基本原理：将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相色谱/质谱仪对其进行分析。

试剂、生产厂家以及产品编号：使用方法：1.取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mMNH4HCO3中，PH 8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。

2.加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。

3.将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。

4.加入25微升1M新鲜配制在1M NaOH中的Iodoacetic acid，在避光、室温条件下放置30分钟。

5.将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centriconfilter，以12000rpm离心50分钟。

6.在以上离心管中分别加入200mL 0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。

多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。

7.将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL 0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加入500mL 0.1M的NH4HCO3溶液。

使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。

8.将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。

9.分别吸取上述样品500mL到两个Centricon filter中，以13400rpm离心50分钟。

这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。

(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)10.将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。

此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。

继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。

11.加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。