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wb转膜条件公式【原创实用版】目录1.WB 转膜的定义和作用2.WB 转膜条件公式的构成3.如何应用 WB 转膜条件公式4.WB 转膜的常见问题和解决方法正文一、WB 转膜的定义和作用WB（Western Blot）转膜，又称为蛋白质转移，是蛋白质电泳技术中的一个重要步骤。
在 WB 实验中，将电泳分离后的蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）转移到尼龙膜（Nylon）或其他固相支持物上，以便进行进一步的检测和分析。
这一过程可以实现对蛋白质的定性和定量分析，为研究蛋白质的表达和功能提供有力依据。
二、WB 转膜条件公式的构成WB 转膜条件公式主要包括以下几个参数：1.转膜液：常用的转膜液为磷酸缓冲液（pH 7.4），能保持膜的稳定性和电荷特性。
2.转膜电压：转膜电压是驱动蛋白质从凝胶向膜转移的动力，通常选择在 50-100V 之间。
过高的电压可能导致蛋白质丢失或降解，过低的电压则可能影响转膜效率。
3.转膜时间：转膜时间取决于蛋白质的大小、电荷和转膜液的离子强度等因素。
一般来说，转膜时间越长，蛋白质转移的量越多，但也可能导致非特异性吸附增加。
通常转膜时间为 30 分钟至 2 小时不等。
4.转膜温度：转膜温度一般在 4-50 摄氏度之间选择。
温度过高可能导致蛋白质变性，影响转膜效果；温度过低则可能使转膜过程过于缓慢。
三、如何应用 WB 转膜条件公式在实际操作中，可以根据实验目的和蛋白质特性，结合转膜条件公式选择合适的转膜条件。
以下是一个简单的示例：假设我们研究的蛋白质分子量为 50kDa，带负电荷。
根据其大小和电荷特性，我们可以选择如下转膜条件：转膜液：磷酸缓冲液（pH 7.4）转膜电压：75V转膜时间：1 小时转膜温度：37 摄氏度四、WB 转膜的常见问题和解决方法在 WB 转膜过程中，可能会遇到一些问题，如蛋白质转移不充分、背景较高等。
针对这些问题，可以采取以下措施进行解决：1.提高转膜电压和时间，以增加蛋白质转移量。
wb转膜时间过长条带的变化
WB（Western blotting，蛋白质印迹法）转膜时间过长可能会导
致条带出现一些变化，具体变化可能因实验条件和蛋白质的性质而异，但通常会出现以下情况：
1. 条带变弱或消失：转膜时间过长可能导致蛋白质从凝胶中迁移
到膜上的效率降低，从而使条带的强度变弱或完全消失。
2. 条带扩散：如果转膜时间过长，蛋白质可能会在膜上扩散，导
致条带变宽，清晰度降低。
3. 背景增加：转膜时间过长可能会增加非特异性结合，导致背景
噪音增加，使目标条带的识别变得困难。
为了获得最佳的结果，转膜时间通常需要根据实验条件和蛋白质
的特性进行优化。
一般来说，转膜时间应该在适当的范围内，以确保
蛋白质有效地转移到膜上，同时尽量减少条带的扩散和背景噪音。
如果你发现转膜时间过长导致条带异常，可以尝试缩短转膜时间、优化转膜缓冲液的成分、调整蛋白上样量等方法来改善结果。
同时，也要确保其他实验步骤的准确性，如凝胶电泳、抗体孵育等，以获得可靠的 Western blotting 结果。
Western 快速转膜液(Powder)产品简介：碧云天生产的Western 快速转膜液(Powder)，即Western Rapid Transfer Buffer (Powder)，是一种粉末形态的安全无毒的用于Western 时湿法快速转膜的缓冲液。
本产品转膜快速。
使用本快速转膜液时，在400mA 恒流转膜约20-25分钟即可将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜或硝酸纤维素膜(NC 膜)等印迹膜上，并且产热少，转膜效果好。
而相同的条件下使用传统的转膜液需要转膜更长时间。
本产品安全无毒害。
本产品为预混粉末(powder)，使用前需要用水和乙醇配制，但无需调节pH 值。
本产品不含有毒有害组分，也无需使用剧毒的甲醇等试剂。
本快速转膜液的转膜效果与传统转膜液一致或略优。
本快速转膜液与传统转膜液在转膜前后的效果比较请参考图1。
图1.Western快速转膜液与传统转膜液在转膜前后的对比效果图。
上图为使用本快速转膜液的效果图，下图为使用传统转膜液的效果图，转移电极芯组件中放置两个转移三明治夹进行转膜，仅用内置冰盒进行降温。
凝胶为BeyoGel™ Plus PAGE 预制胶(Hepes, 4-20%, 15孔) (P0524)，凝胶厚度为1.5mm ；蛋白分子量标准分别为彩色预染蛋白质分子量标准(10-180kD) (P0068/P0069)和BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，上样量为6μl ；传统的转膜液为Western 转膜液(P0021A/B)；PVDF膜为PVDF 膜(进口分装, 6.6×8.5cm, 0.45μm) (FFP33)；转膜设备为MiniBlot™蛋白转膜系统(E6050)；转膜电源为BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。
实际转膜效果会因实验条件、仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
wb转膜条件公式（原创实用版）目录1.WB 转膜的定义和目的2.WB 转膜的常用方法3.WB 转膜的条件公式4.WB 转膜的注意事项5.总结正文一、WB 转膜的定义和目的WB（Western Blot）转膜，又称为免疫印迹转膜，是一种将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）转移到固相支持物上的技术。
其主要目的是为了将电泳分离得到的蛋白质样品，转移到固相载体上，以便于进行后续的免疫学检测和分析。
二、WB 转膜的常用方法WB 转膜常用的方法有以下几种：1.湿式转膜：湿式转膜是最常用的 WB 转膜方法，其主要原理是利用电场和分子渗透作用，将蛋白质从凝胶中转移到固相载体上。
2.干式转膜：干式转膜则是通过暴露于干燥的气氛中，使得凝胶中的蛋白质与固相载体上的抗体结合，然后再进行洗涤和检测。
3.半干式转膜：半干式转膜则是湿式转膜和干式转膜的结合，一部分采用湿式转膜，一部分采用干式转膜。
三、WB 转膜的条件公式在进行 WB 转膜时，需要控制的条件包括：1.转膜缓冲液：转膜缓冲液的 pH 值、离子强度和蛋白酶抑制剂的浓度等，都会影响到蛋白质的转膜效果。
2.转膜时间：转膜时间过长或过短，都会影响到蛋白质的转膜效果。
3.转膜温度：转膜温度一般控制在 12-18℃，温度过高或过低都会影响到蛋白质的转膜效果。
4.固相载体：固相载体的选择和处理，也会影响到蛋白质的转膜效果。
四、WB 转膜的注意事项在进行 WB 转膜时，需要注意以下几点：1.保持实验操作的无菌性，以防止细菌污染。
2.选择合适的转膜时间和温度，避免过度转膜或转膜不足。
3.选择合适的固相载体，并正确处理和封闭。
4.使用高质量的转膜缓冲液，避免缓冲液中蛋白酶的干扰。
五、总结WB 转膜是蛋白质研究中常用的技术，其操作需要注意控制转膜缓冲液、转膜时间、转膜温度和固相载体等条件。
Western转膜实用技巧，赶紧Get起来Western实验中，经过SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质样品需经过“转膜”步骤，从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显示，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转膜要尽快进行。
转膜是对Western最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。
下面介绍一些实用技巧，赶紧Get起来吧1. 膜的选择膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定，从而影响最终结果的可靠性。
通常小于20KDa的蛋白选择0.2um 的膜，而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。
常见的膜有NC膜和PVDF膜，区别如下：2. 转膜条件不同分子量的蛋白质选择的凝胶浓度和转膜时间也是不同的，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，转膜时间较长，而低分子量蛋白用高浓度胶分离，采用较短的转3. 转膜操作注意事项（1）避免直接接触膜，全程戴手套并使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；（2） PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；（3）排列三明治时，尽量用干净的玻璃棒或试管赶走胶和膜之间的气泡，避免转膜不均匀；（4）确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效；（5）鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高背景，故如果选择鸡来源的抗体，最好使用**纤维素膜（NC膜）4. 转膜后丽春红染色为检测转膜是否成功，可以用丽春红进行染色，将膜放入TBST洗一次，然后置于丽春红染色工作液中，室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜，直至水变清无色，蛋白条带清晰。
Western Blot 常见问题汇总分析。
WB转膜原理一、什么是WB转膜在分子生物学研究中，Western blotting（WB）是一种常用的蛋白质检测方法。
它通过将蛋白质分离、转移到膜上并用特异性抗体进行检测，能够准确地检测目标蛋白质的存在和表达水平。
WB转膜是WB技术中的一个重要步骤，它将已经分离得到的蛋白质转移到固体支持物上，常用的支持物包括聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯二醇脲醛膜等。
WB转膜的目的是为了将蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便后续的抗体检测。
二、WB转膜的原理WB转膜的原理是利用电场作用将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
在转膜过程中，电场会使得蛋白质向阳极（阳极移动），因此要将膜放置在阳极一侧，凝胶放置在阴极一侧。
具体的WB转膜原理可以分为以下几个步骤：1. 准备工作首先，需要将蛋白质样品经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分离，得到蛋白质的条带。
2. 选择合适的膜和缓冲液根据蛋白质的大小和特性，选择合适的膜和缓冲液。
常用的膜有聚乙烯二醇脲醛膜、聚偏氟乙烯膜等，常用的缓冲液有传输缓冲液（Tris-glycine buffer）等。
3. 建立电场将薄膜强制充湿于转印缓冲液中，然后将其与蛋白质凝胶层叠加在一起。
在薄膜上放置一个合适大小的吸水纸，再将层叠的凝胶和薄膜叠放在一个转印装置中，加上电源连接转印装置。
4. 转膜过程打开电源，通电进行转膜。
在转膜过程中，蛋白质会受到电场的作用，向阳极（薄膜）方向移动，逐渐从凝胶中转移到薄膜上。
5. 后续处理转膜完成后，将薄膜取出，可进行一些后续处理，如用Ponceau S染色检测转膜效果、去除Ponceau S染料、进行蛋白质的染色检测等。
三、注意事项和常见问题在进行WB转膜时，需要注意以下几点：1. 转膜条件的选择转膜条件包括转膜时间、电压和电流等。
不同的蛋白质样品可能需要不同的转膜条件，因此需要进行优化。
一般来说，转膜时间较长，电压较低，可以得到较好的转膜效果。
2. 防止蛋白质传输不完全蛋白质转移到薄膜上的效率可能受到多种因素的影响，如蛋白质的大小、电场的强度和转膜时间等。
western转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“Bio-Rad mini”。
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压 12 V转膜时间：30-40 min设备：“Bio-Rad mini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。
蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。
转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压转膜时间：90 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两张膜0.3 A。
western转膜western blot转移电泳一般操作流程总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。
胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。
合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。
变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。
现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：槽式转印半干转印Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米转移参数凝胶夹数 2 -缓冲液要求450ml ≤200 ml电极距离4cm 按夹层结构厚度确定转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管-凝胶容量18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米-13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列8.6 x 6.8 厘米通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。
所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。
电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
Western blot是一种分析蛋白质的实验技术，它通过分析蛋白质在凝胶中的迁移和捕获来检测特定蛋白质的存在和浓度。
在进行Western blot分析时，大蛋白的转膜条件是非常重要的，它直接影响着实验结果的准确性和可重复性。
1. 背景介绍西方博Lot实验作为一种重要的蛋白质分析技术，在生物科学研究中得到了广泛的应用。
Western blot通过分析蛋白质在凝胶中的迁移和捕获来检测特定蛋白质的存在和浓度。
在Western blot实验中，样品首先需要通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，然后转移到膜上，最后用抗体进行特定蛋白质的检测。
而大蛋白的转膜条件对Western blot 实验的结果起着关键的作用。
2. 大蛋白大蛋白通常指的是相对分子质量较大的蛋白质，其分子量一般在100kDa以上。
这类蛋白质在Western blot实验中转膜时往往会面临一些特殊的挑战，比如易于聚合、迁移速度较慢等问题，因此需要在转膜条件中予以特别考虑。
3. 转膜条件的重要性合适的转膜条件是确保大蛋白转膜效果的关键。
只有在适当的条件下，大蛋白才能迅速而均匀地从凝胶中转移到膜上，避免出现聚合和不均匀转膜等问题，从而保证Western blot结果的准确性。
4. 转膜条件的优化为了得到最佳的转膜效果，实验者需要在转膜条件上进行一系列的优化实验。
具体来说，可以对转膜膜的种类、孔隙大小、电泳缓冲液的成分和pH值、电场强度、转膜时间等因素进行系统的优化。
另外，选择合适的转膜设备和相关试剂也是提高转膜效率的关键。
5. 转膜膜的选择转膜膜是影响大蛋白转膜效果的重要因素之一。
常用的转膜膜有聚偏氟乙烯(PVDF)膜和硝化纤维素(NC)膜。
PVDF膜具有较好的耐性和机械规整性，适用于转膜大蛋白；而NC膜则对一些亲脂性较强的蛋白质有更好的结合效果。
实验者可以根据具体实验需要选择合适的转膜膜。
6. 电泳缓冲液的优化电泳缓冲液的成分和pH值对蛋白质的迁移速度和迁移效果有直接影响。
western转膜条件蛋白来源：总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70KDWB用膜类型、孔径：转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA转膜时间：60~90minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin&AKT蛋白分子量：65KD&56KDWB用膜类型、孔径：转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100V转膜时间：60~70min设备名字是“Bio-Radmini”。
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65KD&55KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12V转膜时间：30-40min设备：“Bio-Radmini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。
蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95KD&35KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。
转膜时间：70min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流转膜时间：150min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流转膜时间：150min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16KDaand42KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120V恒压转膜时间：90min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72KD，42KD和22KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜，两张膜。
wb转膜条件公式摘要：1.WB 转膜的概述2.WB 转膜的条件公式3.WB 转膜的实际应用正文：一、WB 转膜的概述WB（Western Blot）转膜是一种常用的生物技术实验方法，主要用于将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳转移到尼龙膜上。
这一过程是蛋白质研究、表达和检测的关键步骤，为后续的蛋白质鉴定和分析提供了重要的基础。
二、WB 转膜的条件公式WB 转膜的条件公式通常包括以下几个关键因素：1.转膜液：转膜液的成分和浓度对蛋白质的转移效率至关重要。
一般采用含有20% 甲醇、7% 醋酸和1%SDS 的缓冲液作为转膜液。
2.转膜时间：转膜时间与蛋白质的大小、电泳分辨率以及转膜液的浓度等因素有关。
通常情况下，转膜时间为60-90 分钟。
3.转膜温度：适宜的转膜温度有利于蛋白质的快速转移。
一般采用40-50℃的恒温箱进行转膜。
4.电压：适当的电压可以保证蛋白质在电场作用下快速转移。
通常电压设置为100-200V。
5.尼龙膜：尼龙膜的选择对蛋白质的转移效果和检测灵敏度有很大影响。
常用的尼龙膜有PVDF、硝化纤维素等。
三、WB 转膜的实际应用WB 转膜在生物科学研究中具有广泛的应用，主要包括：1.蛋白质表达水平分析：通过比较不同实验组和对照组的蛋白质转膜结果，可以评估蛋白质表达水平的差异。
2.蛋白质亚基分析：通过转膜实验可以检测蛋白质亚基的存在和相对比例。
3.蛋白质修饰分析：WB 转膜可以用于检测蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等。
4.蛋白质互作研究：通过转膜实验可以筛选与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
总之，WB 转膜作为蛋白质研究中的关键技术手段，其条件公式的掌握对于实验的成功与否至关重要。
WB快速转膜液的使用方法及步骤WB（Western blot）快速转膜液主要用于Western blot实验中的蛋白电泳转膜步骤，下面是其详细的使用方法及步骤：一、实验前准备：1.将WB快速转膜液从-20℃冷冻保存条件迅速转移到4℃冷藏保存条件下，使其溶解均匀，放置2小时。
2.取出所需的PVDF或NC膜，并用TBST缓冲液浸泡20分钟，去除其中的有机溶剂。
二、电泳结束后进行转膜：1.关闭电泳仪电源，在电泳槽中小心取出胶片和蛋白质凝胶。
2.使用无菌镊子或无菌手套，将蛋白质凝胶上胶及下胶用纸快速剥离，并在电泳槽中洗净。
3.高分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗2次，10分钟/次；低分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗1次，10分钟。
4.将含有蛋白质的凝胶快速转移到已浸泡在TBST缓冲液中的PVDF（或NC）膜上。
5.如有需要，先用标尺切割PVDF（或NC）膜，使其与凝胶大小相匹配。
三、转膜条件：1.将蛋白质凝胶和膜夹在两片不含泡沫的海绵之间，并同时将其与孔板或纸张夹在一起。
2.通过应用约100V的恒定电流进行转膜。
用正极连接电源端口上的红色插孔，负极连接黑色插孔。
3.根据样品大小和此前实验数据，预计转膜时间一般为1-2小时。
如果处理过的样品非常大，转膜时间可能需要延长。
四、将洗膜：1.在转膜完成后，将膜快速从转膜装置中取出，用冷缓冲液迅速冲洗转印膜以去除残余的凝胶。
2.将膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST中的封闭沉淀液中，封闭30-60分钟。
五、主要试剂的准备：1. 酶标仪AB染色液准备：根据需要的体积，按照1：50的稀释比例将染色缓冲液（5x）稀释成1x稀释液中。
例如，对于20ml AB染色液，需要将0.4 ml染色缓冲液稀释成20 ml 1x稀释液。
2.抗体溶液准备：将所选择的一抗或二抗按照所需体积稀释成1xTBST中的合适浓度。
六、探测步骤：1.将膜与所选择的抗体孵育，通常在4℃下过夜。
2.将膜置于摇床上，与所选择的一抗或二抗孵育30分钟。
western blot转膜原理
Western blot转膜技术是一种基于免疫学原理的蛋白质检测技术。
其原理是先将待检样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出不同分子量的蛋白质，然后将这些蛋白质从凝胶上转
移到含有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜上进行检测。
Western blot转膜的过程主要包括以下几个步骤：
1. 凝胶电泳：将蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使样品中的蛋白质按
照分子量大小被分离出来。
2. 转膜：然后将凝胶与带有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜接触，并施加足够的
压力，使蛋白质从凝胶上转移到支持膜上。
3. 阻滞：为了避免未特异性结合的抗体与膜上的非特异性蛋白质结合，需要给膜进
行一定的阻滞处理，通常使用牛血清蛋白或BSA（牛血清白蛋白）进行阻滞处理。
4. 一抗结合：将特异性抗体加入到膜上，使其与相应的蛋白质结合。
5. 二抗结合：加入标记有酶或荧光基团的第二抗体，使其与一抗结合。
6. 信号检测：通过溶液中特定底物的反应，使标记有酶或荧光基团的二抗在膜上呈
现出特定的荧光或酶促反应产生的色素。
7. 结果分析：根据荧光或色素的强度、位置或大小来分析样品中所含有的蛋白质种类、含量以及存在的修饰状态等。
总之，Western blot转膜技术是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测方法。
其原理简单易懂，操作简便，广泛应用于分子生物学、免疫学、生物化学等领域中的蛋白质表达、诊断和研究。
转膜:小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。
具体转膜条件需要多摸一下。
30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。
湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
显影:转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。
显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。
暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。
要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。
蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。
干转的话，用2.5 A/cm2，30min就应该够了。
湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。
转膜时何为湿法，何为半干法？解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
1，转膜不充分/过转对于非小分子量尤其是大分子量(〉100kd)蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流,延长时间.但对于小分子蛋白（〈30kd就要注意了，〈15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶,如果是一片空白,则要小心了，可适当降低转膜力度。
对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转,《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的.2,封闭时间不足这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。
我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的.另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。
3,抗体与封闭液有交叉。
实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。
BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景.单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低.4，抗原-抗体浓度过高一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量.5，暴光时间过长降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。
6,抗原—抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。
7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)主要是气泡在胶—膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上,这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。
我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边,这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。
把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生.8，抗体交叉反应，形成非特异性条带非特异性条带在普通多抗比较多见,纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有,我也遇到过.关于western 的抗体选择在此提出我的观点:最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定.考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格.混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合,很少有人这么做。
western blot转移电泳一般操作流程
总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。
胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。
合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择
对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。
变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。
现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：
槽式转印半干转印
Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米
转移参数
凝胶夹数 2 -
缓冲液要求450ml ≤200 ml
电极距离4cm 按夹层结构厚度确定
转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟
冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管-
凝胶容量
18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米-
13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列
8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个
凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列
8.6 x 6.8 厘米
通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。
所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。
电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。
需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。
经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用
丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。
具体的对于电压/电流的选择，可以参照下表。
但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。
SDS-PAGE Gels (Towbin Buffer)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/90 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 60 min
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min Isoelectric Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic acid)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/10 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 1 hr
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min。
