下载文档原格式
Western blot操作步骤及技巧实验器材：电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM）实验试剂：SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液实验步骤：一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%）1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干；2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡；3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净;4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二、样品处理1.悬浮细胞：a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS洗1遍；b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分；c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；2.贴壁细胞：a)去培养液后用温的PBS冲洗1遍，尽量去除残留PBS；b)加入适量的冰预冷的裂解液（6孔板细胞密度在80%左右，每孔加100-200μl裂解液,浓度在2-4μg/μl左右）后置于冰上30min，期间不断震荡培养板，使裂解充分；c)收集细胞裂解液在EP管后4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；3.组织：a)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
操作篇：westernblot之转膜转膜篇1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。
要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
要领：（1）「用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡」，要领：一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
（2）「在上面垫一张海绵垫」要领：可三张纸先叠在一起在垫于垫子上。
个人感觉就垫 1 张滤纸也没问题。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
要领：（1）「要在两个边上轻轻的反复撬」要领：应该边撬边用流水缓缓冲洗（2）「直到撬去玻板」要领：撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲（3）转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
（4）最后做成的「三明治」千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。
Western 转膜方法及转膜仪使用说明实验前准备：转移缓冲液: 甘氨酸（MW75.07）2.9gTris（MW121.14）5.8gSDS 0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。
如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）。
缓冲液可室温保存，但最好保存在4度冰箱，可重复使用3～5次（最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
TBS缓冲液: 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）10mlNaCl 8.8g蒸馏水至1000ml（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）TBST缓冲液: 20％Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液：BSA 0.5gTBST 100ml最好现用现配。
操作步骤：（一）SDS－PAGE电泳样品准备：取出上样样品至1.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）（二）电泳浓缩胶时用80V跑1h左右，到分离胶以后用120跑，总时间3h左右）。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker）。
（三）转膜（1）转一张膜需准备滤纸和1张PVDF膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的PVDF膜置于水上浸10min才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。
下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。
1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。
目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。
WB快速转膜液的使用方法及步骤NcmBlot Rapid Transfer Buffer 快速转膜液是新赛美生物研发的一种高达20 倍浓度的高效转膜液，用于Western Blot 湿转法转膜，能高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF或硝纤膜）上。
不使用甲醇，能在15-30 分钟内完成转膜过程。
操作步骤
1 1：：1X 快速转膜液的配制（1000 ml）：取50 ml 快速转膜液（20X）+850 ml 去离
子水+100 ml 无水乙醇
2 2 ：做好转印三明治结构，然后转移至电泳槽中，设定恒流400 mA，电泳时间25-30
分钟完成蛋白转膜。
注意：PVDF 膜使用前要用无水甲醇润湿0 30 秒以上。
转印电流建议设定恒流, 400mA, 一般0 25-30 分钟可以将D 150kD 以下蛋白完全转印；小于D 100kD 蛋白0 20 分钟即可完全转印；对于大于D 150kD 蛋白，建议延长0 5-10 分钟。
凝胶的浓度影响转印的效率，对于胶浓度7.5%,20 分钟即可完成转印；对于胶浓度10%,25-30 分钟即可完成转印；对于胶浓度大于10%, 建议延长0 5-10 分钟
(4)40 分钟时间内转膜不需要放冰上，转膜槽内外都不可放冰预冷，否则会影响效率。
Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
用前用酒精干燥。
2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。
胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。
）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。
上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（在缓冲液中加样。
）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。
Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。
B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。
二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。
Western Blotting （His-tag ）一、SDS-PAGE 电泳Sample 加入5×SDS Loading ，99℃、5分钟热处理，SDS －PAGE 电泳。
使用 Marker ：M1：Precidion Plus ProteinTM Dual Color Standards 5μl （Bio_Rad Catalog 161-0374） M2：Perfect ProteinTM Makers 10-225KDa 5μl （Novagen Catalog 69079）二、转膜（Blotting ）1、裁剪SDS －PAGE 胶，使所有样品、Marker 均包含在内，量取裁剪后胶的 长×宽，并裁剪相同尺寸的转膜滤纸12张，PVDF 膜1张；2、将PVDF 膜用甲醇浸泡10秒；3、将胶、转膜滤纸、PVDF 膜分别浸泡在如下图所示的相应转膜缓冲液中3~5分钟；4、依次按照下图所示的顺序在转膜仪的下表面叠放胶、转膜滤纸、PVDF 膜，用干净面巾纸拭干滤纸周围多余的液体，将转磨仪上表面安装好，轻轻下压上盖，使其与滤纸充分接触；5、按照胶尺寸1cm 2= 1mA 设定电流， 转膜120 min 。
三、封闭（Blockin ）1、配制Blockin 溶液，一般40ml 较合适（Blockin ：10ml 、一抗：14ml 、二抗：14ml ）；2、确认转移转膜后PVDF 膜上Marker-M1清晰，此时转膜成功；3、将转印后的PVDF 膜装入干净的水煮袋中，加入10ml 1.5%BSA/TBST ，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT 、摇动1hr 或4℃、O/N 封闭。
四、一抗1、取出封闭后的PVDF 膜，转入新的水煮袋中；A 液（负 极）（正极）C液B液胶PVDF膜2、加入14ml 1.5%BSA/TBST，按照1000：1的比例加入14μl一抗——Penta-HisAntibody, BSA free(QIAGEN Code.34660)，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT、摇动1hr进行反应。
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
