[原创]-Western-blot转膜整个过程

Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。

Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。

前处理样本并测定蛋白质浓度。

准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。

2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。

接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。

开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。

3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。

使用电转印或半干转印设备进行转移。

4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。

一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。

5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。

根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。

6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。

通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。

7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。

封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。

孵育时间需要优化。

8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。

重复步骤6的清洗方法。

9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。

等待信号产生并记录结果。

测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。

10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。

以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。

westernblot法原理
westernblot原理：蛋白质的电泳分离。

是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。

然后4℃，13,g离心15min。

取上清液作为样品。

（二）电泳：制取电泳凝胶，展开sds-page。

（三）转移：（半干式转移）
1、电泳完结后将胶条割至最合适大小，用转膜缓冲液均衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序摆不好，滤纸、凝胶、nc膜准确对齐，每一步除去气泡，另一头g重物，将碳板上多余的液体化成。

拨打电源,恒流1ma/cm2，迁移1.5hr。

迁移完结后，断裂电源将膜抽出,生口待测膜条搞免疫系统印迹。

组织蛋白质抽提取-80℃冰冻的大鼠大脑皮质、海马组织，1mg组织加10ulRIPA，并加入蛋白酶抑制剂cocktail，加入PMSF，用电动匀浆器低速匀浆30秒，至组织完全裂解。

冰上孵育30min。

之后离心(4℃，12，000xg离心20分钟)，吸取上清，移至新的冻存管中置于-80℃冰箱保存待用。

样品变性：取预冷的25ul 5×SDS加样缓冲液加入100ul样品中，混匀，煮沸10min。

SDS-PAGE电泳（根据分子量选择不同的胶浓度）分离胶浓缩胶灌胶、上样：取一套干净的玻璃板（0.75mm），擦拭干净，按次序放置，用固定夹夹好，固定在制胶架上。

将分离胶5 ml(or 10 m1)灌入约2/3，加水或无水乙醇或异丙醇或SDS（0.1%）或正丁醇压实，待凝后（20--30min），倒出水，滤纸吸干；将配好的2ml积层胶灌入，将梳子插入，待凝后拔出梳子。

装入电泳槽内，梳子面朝里，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，内液面略高于外液面，拔出梳子，按预定顺序加样，每样品加20ul。

设预染Marker孔。

将电泳装置与电源相接，红对红，黑对黑。

凝胶上所加电压80V，当染料前沿进入分离胶后(30min)，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝刚跑出来，关闭电源。

转膜：6张滤纸l张硝酸纤维素膜把凝胶转移到一盘转移缓冲液中略为漂洗，滤纸、垫片、夹子、膜也浸入其中转膜叠放顺序：白色板-三层海绵-3层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-3层滤纸-三层海绵-黑色板黑对黑，白对红，连接电源，0.33A（0.8～3.0mA/cm2），90min。

转膜槽放在冰中。

转膜完毕断开电源从上到下拆卸转移装置，用镊子（防手上蛋白污染膜）逐一掀去各层丽春红检测：用丽春红检测有无条带，用TBST冲洗直至红色条带消失封闭：封闭液（含10%脱脂奶粉的TBST）封闭2h，室温，一般20～24℃TBST稍微洗一下或不洗即可进行抗体孵育一抗孵育：适宜稀释倍数一抗（一般用TBST稀释，含2%的BSA（牛血清白蛋白,为终浓度））孵育置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜（12h以上），或室温孵育3h，均在摇床上TBST洗膜10mi n×3次二抗孵育：适当稀释倍数HRP标记的二级抗体，置于湿盒中，室温孵育2hTBST洗膜10mi n×3次抗体孵育及TBST漂洗过程都在摇床上进行。

Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。

2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。

使用终浓度为1 mmol/L 。

【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。

PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。

Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。

2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。

2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。

倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。

3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。

4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。

6.接通电源，积层胶电压为60V。

7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。

8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。

9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。

11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。

12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。

13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。

14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。

献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。

下面就跟大家讲讲接下来的步骤。

四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。

对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。

1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。

转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。

切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。

PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。

目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。

也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。

之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。

在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。

最详细的WesternBlot过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t过程步骤详解Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。

因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

通常用0.45 μm和0。

2 μm两种规格的NC膜。

大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。

2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。

PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。

硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。

B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。

二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。

Western Blot步骤
1. 将得到的样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳;
2. 电泳后，去掉积层胶（也可留），用剪刀剪下与分离胶大小相同的滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，大小为5.5x8.5 cm。

（裁减NC膜时带手套）
3. 滤纸、NC膜、凝胶及海绵在1X转移缓冲液中浸泡5分钟后，按负极板、海绵、3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸、海绵、正极板的顺序组装成“三明治”结构(在浸泡时，用镊子将它们摆放整齐)；然后在100V的电压下，冰水中转膜0.5-2小时。

根据目的蛋白大小而定，小分子蛋白需要时间短。

1X转移缓冲液（10xbuffer :ddH2O:甲醇＝80ml:720ml:200ml）
4. 卸下转膜装置，将NC膜转到培养皿，用TBST溶液洗3次，各5分钟；
7. 用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭膜上空白位点，30分钟（可过夜）；多余的含5%脱脂奶粉的TBS溶液可以用来配制后面所需的1%脱脂奶粉的TBS溶液。

9. 一抗孵育：（用含1%脱脂奶粉的TBS溶液将一抗稀释1000倍）与NC膜温育1小时；反应液量是NC膜面积的1/10，如40cm加4-6ml。

10. TBST溶液洗膜三次，每次5分钟；
11. 二抗反应液（含1%脱脂奶粉的TBS溶液将二抗稀释2000倍）与NC膜温育1小时；
12. TBST溶液（TBS含0.05% V/V Tween-20）洗NC膜三次，每次5分钟；
13. 化学显色：按华美公司或其它公司的NBT/BCIP试剂盒说明书配置AP显色液；与NC膜在黑暗处反应，至有清晰的条带出来后，ddH2O洗三遍，终止反应。

westernblotting实验操作步骤讲解蛋⽩免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋⽩样本通过聚丙烯酰胺电泳按分⼦量⼤⼩分离，再转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。

WB 是进⾏微量蛋⽩质分析⽐较成熟的技术之⼀。

以下是总结Western Blot 操作⽅法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第⼀部分：蛋⽩样本提取制备蛋⽩样品制备是Western Blotting的第⼀步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取⽬的蛋⽩（通过采⽤不同提取⽅法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋⽩处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表⾯活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防⽌蛋⽩降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加⼊合适的蛋⽩酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等⼲扰分⼦（通过加⼊核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

⽅法的选择◆⾃⾏配制抽提试剂，根据⽂献⽅法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的⽅法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋⽩，具体实验过程如下：1.提前⼀天4℃解冻RIPA，⼀定要完全融化；配PBS（⽤于细胞试验则需⾼压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临⽤临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离⼼10min，取上清。

4.蛋⽩定量：取少量上清稀释30倍蛋⽩定量，然后计算出各样本原液蛋⽩浓度。

注意由于裂解液⾥含有较⾼浓度的洗涤剂，蛋⽩定量不能选⽤Bradford法，可以选⽤改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋⽩浓度均⼀化：根据蛋⽩定量计算的结果将各样品蛋⽩浓度调整⼀致。

Western blot操作步骤(半干转移)（1）提取细胞全蛋白，提取过程注意低温操作，防止蛋白降解。

（2）蛋白定量后，取相应蛋白与上样缓冲液混合，沸水浴5min是蛋白变性，取出后10000rpm离心1分钟，吸取蛋白样品20μl、5μl Marker上样，电压80V 电泳30min，待蛋白移行至分离胶电压改为120V继续电泳40分钟。

（3）初次实验考马斯亮蓝染色1小时，脱色至条带清晰观察蛋白纯化情况，参考考马斯亮兰R250染色结果，记录目的蛋白位置，以指导转膜时切胶位置。

（4）对SDS-PAGE电泳后的凝胶进行切胶，参考切下的凝胶大小，准备两片3mm- Whatman滤纸，滤纸比凝胶稍大，下片滤纸略大于上片滤纸，将滤纸和凝胶在转膜缓冲液中浸泡30分钟。

（5）将PVDF膜切成与凝胶一样大小，切角做好记号。

甲醇浸泡2分钟。

（6）按照“滤纸- PVDF膜（光面向上）-凝胶-滤纸”的顺序铺在半干转移的阳极板上，盖上阴极板，接通电源，10V转膜30分钟。

（7）转膜完毕，取出膜置于TTBS封闭1小时。

（8）TBST洗膜5分钟，重复3次，以下洗膜时均于摇床温和振摇。

（9）按照1:1000比例，用TBS稀释一抗室温孵育1小时。

（10）TBST洗膜5分钟，重复3次。

（11）按照1:5000比例，用TBST稀释二抗-辣根酶标记山羊抗小鼠/山羊抗兔IgG，室温孵育1小时。

（12）TBST洗膜5分钟，重复3次。

（13）滤纸吸干膜上液体，但是不要使膜完全干燥。

放入胶片盒内保鲜膜上，ECL发光液A液B液各0.5ml,C液1 μl在洁净EP管中混合均匀，半小时内可用。

洗取适量发光液均匀覆盖于膜上，观察条带，盖上保鲜膜，将X胶片压在目的条带上曝光，分不同时间长度曝光，显影、定影、冲洗胶片。

凝胶成像记录结果，Bio-Rad凝胶成像分析软件对X光片上的蛋白条带进行半定量分析。

内参为细胞内总的beta-actin，计算出各处理组的光密度相对值。

WesternBlot原理和操作方法样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样本中提取目标蛋白质。

常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯化等。

提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋白质。

接下来，需要将样品进行电泳分离。

这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。

SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。

电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的带状条带。

接下来是转膜的步骤。

将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。

这通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。

电场将带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。

然后进行免疫反应。

转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。

一般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。

然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。

抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。

最后是图像开发阶段。

Western Blot的图像开发通常是通过酶标记二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。

这意味着在膜上的蛋白质上有特异性抗体结合。

然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，以获得目标蛋白质的图像。

总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用于分析复杂的蛋白质混合物。

它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和分离出特定的蛋白质。

虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。

一：提蛋白：1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。

2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。

3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。

4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。

5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。

6.每孔加200ulA/B混合液。

7.37度半小时。

8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。

562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。

二：跑胶1. 1.0玻板，洗干净2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.预电泳，100v，10-15min8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul9.60v 10-20min，之后100-110v三：转膜1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min4.胶取出，在transfer buffer里泡10min5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h 37度5. pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000ml’PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g sds 10g 加水至1000ml10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g 加水至1000ml1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml。

Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

用前用酒精干燥。

2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。

胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。

）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。

上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

（在缓冲液中加样。

）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。

（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。

）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。

做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。

每次30秒,重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。

(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。

沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

（4）收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。