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第八章荧光免疫技术FluoreSCenCe ImmunoaSsay第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。
二、教学内容1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。
2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。
3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.如下有关荧光免疫技术正确的提法A．直观性检测抗原和抗体B．直观性检测抗原C．直观性检测抗体D．间接检测抗原或抗体E．间接检测抗原和抗体2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度A．10～15℃B．15～20℃C．20～25℃D．25～30℃E．30～35℃3．荧光抗体保存3～4年，应选择A．小量分装、4℃B．瓶分装、4℃C．瓶分装、-10℃D．瓶分装,-20℃E．小量分装、-20℃4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A．光源B．聚光器C．目镜D．物镜E．滤光片5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型A．直接法B．夹心法C．间接法D．补体法E．双标记法6．荧光抗体染色标本的观察时间A．当天B.第二天C．第三天D．1周内E．5天7．荧光抗体闭接法应标记A．抗原B．抗体C．补体D．抗抗体E．抗体及补体8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是A．直接法B．间接法C．双抗体夹心法D．补体法E．双标记法9．荧光抗体间接法可检测A．抗原B．抗体C.补体D．蛋白质E．抗原和抗体lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是A．抗原荧光染色B．抗体荧光染色C．补体荧光染色D．特异性荧光染色E．非特异性荧光染色11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术A．荧光偏振免疫测定B．荧光免疫显微技术C．时间分辨荧光免疫测定D．底物标记荧光免疫测定E．流式荧光免疫技术12．临床药物浓度检测的首选方法A．时间分辨荧光免疫测定B．荧光偏振免疫测定C．荧光免疫显微技术D．流式荧光免疫技术E．底物标记荧光免疫测定13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu)14．去除过度标记的荧光抗体最好用A.搅拌法B.透析法C.盐析法D.凝胶过滤法E.离子交换层析法15．目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITCD.R-REE.Eu3+16．免疫标记技术中发展最早的技术是A.酶免疫技术B.同位素标记的免疫技术C.化学发光免疫技术D.荧光免疫技术E.免疫金银技术17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是A.必须有活性化学基团B.性质稳定C.荧光效率高D.不影响蛋白质的活性E.标记方法简便快速18．决定荧光效率的因素主要是A.物质本身的物理特性B.激发光的波长C.激发光的强度D.溶剂pHE.溶剂极性19．荧光显微镜光路形式为A 衍射光、落射光B.折射光、透射光C. 透射光、落射光D.折射光、衍射光E .散射光、衍射光20．RB200产生的荧光色泽为A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色D.天青色E.褐黑色21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在A.激发滤片与分色镜之间B.分色镜与目镜之间C.物镜与分色镜之间D.物镜与载玻片之间E.光源与激发滤片之间22．能用于抗原定位检测的实验为A.直接法荧光抗体染色B.TRFIAC.荧光偏振免疫分析D.ELISAE.免疫比浊分析23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为A.非特异性荧光染色少B.操作更简便C.可用于抗原的定位检测D.可用于抗原定性检测E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为A.TbB.CeC.EuD.AuE.Zn25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是A.简单易行,特异性高B.敏感度偏低C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括A.亚甲蓝B.甲基红C.碱性复红D.伊文思蓝E.碘溶液27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是A.暗室内观察B.染色后标本立即观察C.37℃观察,效果最好D.不宜长时间观察一个视野E.宜用无荧光镜油28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是A.光源B.滤片C.聚光镜D.电源E.镜头29.不宜用于荧光抗体染色的标本是A.血涂片B.肝印片C.肿瘤切除物切片D.细菌涂片E.尿液30.下述物质不是荧光色素的是A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷E.藻红蛋白(二)多项选择题(x型题)1．对荧光标记物影响的因素有A．pH、温度B．溴化物、碘化物等杂质C．荧光素的浓度D．细胞固定剂E．化合物2．常用的荧光素是指A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu2+)3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求A．尽量保持抗原完整性B．切片尽量薄C．用丙酮或乙醇固定D．制好的标本尽快染色E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存4．荧光免疫显微技术在临床可用于A．血清中自身抗体的检测B．各种微生物的快速检查和鉴定C．寄生虫感染的诊断D．白细胞分化抗原的检测E．HLA分型检测5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点A．抗原或抗体的定位B．抗原或抗体的定性检查C．抗原抗体反应的高度特异性D．荧光标本能持久保存E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强6．间接荧光免疫法的优点是A．敏感性高于直接法B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体C．操作时间较短D．不易出现非特异荧光E．反应参与的因素多二、填空题1．荧光免疫技术的主要类型包括()和()。
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。
干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。
-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。
免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)得实验方案)荧光免疫技术就是以荧光物质标记得特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体得分析鉴定与定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术与荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术就是用荧光抗体对细胞、组织切片或其她标本中得抗原或抗体进行鉴定与定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结果,称为荧光免疫显微技术,或就是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定与荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(AＮＡ)为例进行实习、抗核抗体(aｎtinｕclear anｔibodｙ,ANA)又称抗核酸抗原抗体,就是一组将自身真核细胞得各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNＡ、可提取得核抗原(ＥNA)与ＲNＡ等作为靶抗原得自身抗体得总称,能与所有动物得细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液与尿液中、抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Heｐ－2)作抗原片,将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记得抗人ＩgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1.抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备,方法如下:(１)肝印片制备:取4-8周龄小鼠,断颈杀死后,剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块,用生理盐水洗去血细胞,用滤纸吸干渗出得浆液。
将切面轻压于载玻片上,使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干,乙醇固定,冰箱可保存1周。
(2)Hｅｐ—2细胞抗原片制备:Hｅp－２细胞就是建株得人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基。
干燥后,用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备:取小鼠肝组织作冰冻切片,厚４μl。
-3０℃保存备用。
2.异硫氰酸荧光素(ＦITC)标记得抗人IgＧ抗体(FITC—抗人IｇＧ抗体)有商品供应,临用时按效价稀释。
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA)的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体（ANA)为例进行实习。
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞（如Hep—2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上.如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光.试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂.如需自行制备，方法如下：（1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞.冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2）Hep—2细胞抗原片制备:Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基.干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl.-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗人IgG抗体（FITC—抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
