HLA-B27高分辨基因分型的临床
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人类白细胞抗原b27基因检测方法
人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因检测是一种用于确定一个
人是否携带HLA-B27基因的检测方法。
HLA-B27基因与脊柱关节炎
等自身免疫性疾病的发病风险密切相关。
以下是关于HLA-B27基因
检测方法的详细解释:
1. PCR法,PCR(聚合酶链式反应)是一种常用的HLA-B27基
因检测方法。
通过PCR,可以扩增DNA样本中的HLA-B27基因片段,然后利用特定的试剂进行检测。
2. 血清学检测,血清学检测是另一种常见的HLA-B27基因检测
方法。
该方法通过检测血清中的HLA-B27抗体来判断是否患有相关
疾病。
3. 分子生物学方法,分子生物学方法包括Southern blotting、序列特异性引物扩增(SSP)和序列特异性杂交(SSO)等技术,这
些方法可以对HLA-B27基因进行精确的检测和分析。
4. 流式细胞术,流式细胞术结合特定的HLA-B27抗体,可以用
于检测HLA-B27基因的表达水平。
5. 高通量测序,近年来,随着高通量测序技术的发展,可以利用这些技术对HLA-B27基因进行全面的测序和分析。
需要指出的是,HLA-B27基因检测方法的选择取决于实验室的设备和技术水平,以及医生的建议。
在进行HLA-B27基因检测前,应该咨询医生,了解不同检测方法的优缺点,以便选择最适合的方法。
同时,需要注意的是,HLA-B27基因检测结果需要由专业的医生进行解读和分析,以确定相关疾病的风险。
论著 临床研究荧光定量P C R染料法检测强直性脊柱炎患者H L AGB27基因及分型∗罗秀霞,尹志华,张春容,陈㊀杰,叶志中ә,黄进贤(深圳市福田区风湿病专科医院,广东深圳518040)㊀㊀摘㊀要:目的㊀探讨荧光定量P C R染料法检测强直性脊柱炎(A S)患者人类白细胞抗原B27(H L AGB27)基因及亚型的临床应用价值.方法㊀收集2014年1月至2015年3月深圳市福田区风湿病专科医院已确诊的强直性脊柱炎患者血液标本43例和体检健康者血液标本56例,采用流式细胞法检测H L AGB27基因,同时采用荧光定量P C R染料法检测H L AGB27基因及分型.结果㊀流式细胞法检测43例A S患者中40例阳性(93.02%),荧光定量P C R染料法检测39例阳性(90.70%),两者符合率为97.50%.39例H L AGB27者中B2704亚型者有32例(82.05%),B2705亚型者有7例(17.95%).结论㊀荧光定量P C R染料法检测H L AGB27基因准确率高,与流式细胞法有高度一致性,同时还能检测H L AGB27基因亚型,具有很好的临床推广价值和应用前景.关键词:人类白细胞抗原B27;㊀荧光定量P C R染料法;㊀流式细胞法;㊀强直性脊柱炎D O I:10.3969/j.i s s n.1673G4130.2018.13.005中图法分类号:R593.23文章编号:1673G4130(2018)13G1550G03文献标识码:AT h e d e t e c t i o no fH L AGB27g e n e a n d g e n e t y p i n g o f a n k y l o s i n g s p o n d y l i t i s p a t i e n t s b y f l u o r e s c e n c eP C R∗L U OX i u x i a,Y I N Z h i h u a,Z HA N GC h u n r o n g,C H E NJ i e,Y EZ h i z h o n gә,HU A N GJ i n x i a n(S h e n z h e nF u t i a n H o s p i t a l f o rR h e u m a t i cD i s e a s e s,S h e n z h e n,G u a n g d o n g518040,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T o i n v e s t i g a t e t h e c l i n i c a l a p p l i c a t i o n v a l u e o f f l u o r e s c e n c e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n (P C R).i n t h e h u m a n l e u c o c y t e a n t i g e nGB27(H L AGB27)g e n e a n d g e n e t y p i n g d e t e c t i o no f a n k y l o s i n g s p o n d yGl i t i s(A S)p a t i e n t s.M e t h o d s㊀At o t a l o f43c l i n i c a l b l o o ds a m p l e so fA Sa n d56s a m p l e so fh e a l t h y c o n t r o l s w e r e c o l l e c t e d i nS h e n z h e nF u t i a nh o s p i t a l f o r r h e u m a t i c d i s e a s e s f r o mJ a n u a r y2014t oM a r c h2015.H L AGB27g e n ew a s d e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y.H L AGB27g e n ea n d g e n e t y p i n g w a sa l s od e t e c t e db y t h e f l u o r e s c e n c e P C R m e t h o d.R e s u l t s㊀A m o n g43s a m p l e s,40s a m p l e sw e r e H L AGB27p o s i t i v e(93.02%)b y f l o wc y t o m e t r y w h i l e39s a m p l e s w e r e H L AGB27p o s i t i v e(90.70%)b y f l u o r e s c e n c eP C R.T h et o t a lc o i n c i d e n c er a t e w a s 97.50%.A m o n g39p o s i t i v es a m p l e s,32s a m p l e sw e r e H L AGB2704p o s i t i v e(82.05%)a n d7s a m p l e sw e r e H L AGB2705p o s i t i v e(17.95%).C o n c l u s i o n㊀T h e f l u o r e s c e n c eP C R i s a n a c c u r a t em e t h o d t o d e t e c tH L AGB27g e n e a n d p r e s e n t s h i g hc o n s i s t e n c y w i t h f l o wc y t o m e t r y.I t c a na l s od e t e c t t h eH L AGB27g e n e t y p i n g.I tm a yh a v e g r e a t c l i n i c a l a p p l i c a t i o nv a l u e a n d p r o s p e c t s.K e y w o r d s:h u m a n l e u c o c y t e a n t i g e nGB27;㊀f l u o r e s c e n c e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n;㊀f l o wc y t o m e t r y;㊀a n k y l o s i n g s p o n d y l i t i s㊀㊀人类白细胞抗原B27(H L AGB27)是B基因座编码的主要组织相容性复合体Ⅰ类(MH CⅠ)表面抗原,位于第6染色体上.研究发现H L AGB27与强直性脊柱炎(A S)高度相关,是迄今为止所知的与疾病相关性中最强的白细胞抗原.在世界不同地区,约90%~96%的强直性脊柱炎患者携带H L AGB27基因[2],该病起病大多缓慢而隐匿,当影像学检查出现痕迹确诊时,患者病情已经发展到比较严重的阶段,因此病程早期是治疗的关键期.临床检测H L AGB27为早期诊断疑似A S患者提供参考.本研究采用荧光定量P C R染料法检测H L AGB27基因及分型,并与流式细胞术法进行比较,探讨荧光定量P C R染料法检测H L AGB27基因及亚型的临床应用价值.1㊀资料与方法1.1㊀一般资料㊀选取2014年1月至2015年3月在深圳市福田区风湿病专科医院体检的健康者56例,其中男43例,女13例,平均年龄(40.28ʃ10.21)岁;住院并已确诊的A S患者43例,其中男34例,女90551 国际检验医学杂志2018年7月第39卷第13期㊀I n t J L a bM e d,J u l y2018,V o l.39,N o.13∗基金项目:国家自然科学基金资助项目(81102266㊁81301529);广东省自然科学基金(S2013040012296);深圳市科技计划项目(J C Y J20140416094256891);福田区科技计划项目(F TW S201308);深圳市医疗卫生三名工程资助项目(S Z S M201602087).㊀㊀作者简介:罗秀霞,女,主管技师,主要从事自身免疫性疾病的实验室检查研究.㊀ә㊀通信作者,EGm a i l:y e z h i z h o n g@126.c o m.㊀㊀本文引用格式:罗秀霞,尹志华,张春容,等.荧光定量P C R染料法检测强直性脊柱炎患者H L AGB27基因及分型[J].国际检验医学杂志,2018,39(13):1550G1552.例,平均年龄(37.95ʃ9.01)岁.根据修订的纽约标准(1984年)进行A S诊断:(1)下腰背痛的病程至少持续3个月,疼痛随活动改善,但休息不减轻;(2)腰椎在前后和侧屈方向活动受限;(3)胸廓扩展范围小于同年龄和性别的正常值;(4)双侧骶髂关节炎Ⅱ~Ⅳ级,或单侧骶髂关节炎Ⅲ~Ⅳ级.如果患者具备(4)并分别附加(1)~(3)条中的任何1条可确诊为A S.1.2㊀仪器与试剂㊀流式细胞法检测H L AGB27基因采用美国B D公司生产的F A C SC a l i b u r流式细胞仪.H L AGB27检测试剂盒(流式细胞法)[国食药监械(进)字2010第3402056]购自美国B D公司.荧光定量P C R染料法检测H L AGB27基因及分型采用美国A B I公司生产的荧光定量P C R仪(7300型),血液基因组D N A提取试剂盒(离心柱法)购自天根(北京)生化技术有限公司;H L AGB27基因分型测定试剂盒(荧光定量P C R染料法)[国食药监械(进)字2013第3401564]购自天津市秀鹏生物技术开发有限公司.1.3㊀方法1.3.1㊀D N A提取㊀取乙二胺四乙酸(E D T A)抗凝血300μL,按试剂盒说明提取D N A,D N A产物-20ħ保存备用.1.3.2㊀荧光定量P C R染料法检测H L AGB27及分型㊀按试剂盒说明进行操作.P C R循环参数:96ħ2m i n;96ħ20s,68ħ60s共5个循环;96ħ20s,65ħ50s,72ħ45s共10个循环;96ħ20s,63ħ50s,72ħ45s共15个循环,72ħ45s采集荧光;72ħ2m i n;最后加上一个D N A溶解曲线.按说明书进行结果判断.1.3.3㊀流式细胞法检测H L AGB27㊀在测定管中加入30μL抗H L AGB27F I T C/C D3P E抗体和60μL 抗凝血,混匀后室温避光染色15m i n;加入2m L溶血素,2000r/m i n离心5m i n后弃上清,用磷酸盐缓冲液(P B S)洗两次后,再用P B S混悬后上机检测.上机获取细胞15000个检测,结果使用B D公司专用H L AGB27分析软件进行分析.以C D3GP E标记的T 淋巴细胞设门,检测门内细胞抗H L AGB27F I T C信号的平均荧光强度,并与参考值相比较,大于或等于此值判定为H L AGB27阳性,小于则为H L AGB27阴性.1.4㊀统计学处理㊀采用S P S S13.0统计学软件进行分析,根据资料类型采用χ2检验进行统计分析,P<0.05表示差异有统计学意义.2㊀结㊀㊀果2.1㊀流式细胞检测结果㊀流式细胞检测结果显示43例A S患者中40例H L AGB27阳性(93.02%),3例阴性;56例健康体检者中1例阳性,55例阴性.2.2㊀荧光定量P C R染料法检测A S患者H L AGB27及其分型㊀荧光定量P C R染料法结果显示43例A S 患者中39例H L AGB27阳性(90.70%),4例阴性;56例健康体检者全部阴性.39例H L AGB27阳性者中, H L AGB2704亚型的有32例(82.05%),H L AGB2705亚型的有7例(17.95%),未检测出其他亚型.2.3㊀两种方法检测H L AGB27的一致性㊀两种方法检测H L AGB27,只有1例流式细胞法阳性,而荧光P C R法阴性,其余相同.以流式细胞法试剂盒检测结果作为参照,两种试剂盒阳性符合率为97.50%(39/40),差异有统计学意义(χ2=31.444,P<0.05),两种方法具有高度的一致性,见表1.表1㊀㊀两种方法检测H L AGB27比较(n)流式细胞法荧光定量P C R染料法阳性(+)阴性(-)合计阳性(+)39140阴性(-)033合计394432.4㊀两种方法灵敏度㊁特异度㊁阳性预测值和阴性预测值比较㊀流式细胞检测的灵敏度为93.02%,特异度为98.21%,阳性预测值为97.56%,阴性预测值为94.83%;荧光定量P C R染料法检测的灵敏度为90.70%,特异度为100.00%,阳性预测值为100.00%,阴性预测值为93.33%.两种方法差别不明显,见表2.表2㊀㊀两种检测方法的灵敏度㊁特异度㊁阳性㊀㊀㊀预测值和阴性预测值(%)检测方法灵敏度特异度阳性预测值阴性预测值流式细胞法93.0298.2197.5694.83荧光定量P C R染料法90.70100.00100.0093.333㊀讨㊀㊀论㊀㊀H L AGB27是H L AB座上的一组重要等位基因,在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别,诱导免疫反应和调节免疫应答.大量的研究证明A S与H L AGB27强相关[1].目前,检测H L AGB27的方法主要有微量淋巴细胞毒试验检测法㊁流式细胞法㊁聚合酶链反应G序列特异性引物(P C RGS S P)法与荧光定量P C R染料法等[2].微量淋巴细胞毒试验检测法㊁流式细胞术法的检测对象是人类白细胞表面的H L AGB27抗原,其检测结果受细胞纯度㊁补体差异㊁单抗效价及H L A高度多态性的影响,并且会因抗体交叉性反应的影响而可能出现假阳性[3],目前在临床上最常用的就是流式细胞法[4G5].P C RGS S P法与荧光定量P C R等分子生物学检测方法具有特异度强㊁灵敏度高㊁稳定性好,标本可保存及可重复鉴定的特点[6].荧光定量P C R染料法因无需电泳而具有简单,快速的优势;并且试验中不需要取出P C R产物,因此可防止P C R产物污染[7].本研究采用了流式细胞法和荧光定量P C R染料法同时对已经确诊的A S患者进行检测,结果流式细胞法的阳性率为93.02%(40/43),而荧光定量P C R 染料法的阳性率为90.70%(39/43),两种方法阳性符合率达到97.50%,具有高度的一致性,这与侯伟等[8]㊁白世杰等[9]㊁刘巧灵等[10]及叶阿里等[11]的结果1551国际检验医学杂志2018年7月第39卷第13期㊀I n t J L a bM e d,J u l y2018,V o l.39,N o.13相似.人类白细胞抗原是已知人类最复杂的显性多态遗传系统,近年来随着基因分型技术的发展,证实H L AGB27不是单一抗原,而是由多种等位基因所构成的亚型构成,现已确定有44个等位基因,这些亚型存在着人种和地区的差异,同时不同的亚型虽然可能只相差1个或几个氨基酸,但却显示出对A S的易感性和抗性,因此对疑似A S患者进行H L AGB27分型检测,有助于A S的诊断和鉴别诊断.本研究对39例H L AGB27阳性标本检测结果显示H L AGB2704亚型占82.05%,H L AGB2705亚型占17.95%.国内不同地区(包括湖南㊁上海㊁陕西㊁四川)[12G15]的相关报道结果均显示A S患者H L AGB27的亚型以B2704和B2705为主,其中B2704占大多数;而山东地区H L AGB2705亚型占63.33%,H L AGB2704占36.67%[16];内蒙古地区H L AGB2705亚型占49.40%,H L AGB2704占44.50%[9];有可能存在南北地区的差异.而深圳地区外来人口很多,大多数来自中国南方地区,因此本研究结果与上述的4个南方地区的结果相符,主要以H L AGB2704为主.由于本研究的样本数太少,临床资料不是很全,未进行亚型与临床特征的相关性分析,根据已有的研究暂未发现亚型与临床特征如病程㊁活动度㊁分期等有明显的相关性.4㊀结㊀㊀论㊀㊀荧光定量P C R染料法和流式细胞法都是检测H L AGB27的好方法,特异度好㊁准确度高.相比之下,荧光定量P C R染料法还具有设备通用性强,对样本要求低,制备简单,高通量等特点,加上还能同时进行分型检测,因此具有很好的临床推广价值和应用前景.参考文献[1]R O S T OM S,D O U G A D O S M,G O S S E C L,e ta l.N e w t o o l s f o r d i a g n o s i n g s p o n d yGl o a r t h r o p a t h y[J].J i o n t B o n eS p i n e,2010,77(2):108G114.[2]杨霄鹏,惠玲.人类白细胞抗原B27的实验室诊断[J].分子诊断与治疗杂志,2015,7(4):276G279.[3]刘毓刚,李琳,吴丽娟,等.流式细胞法检测人类白细胞抗原B27/B7表达在诊断强直性脊柱炎中的价值[J].国际检验医学杂志,2012,33(2):138G140.[4]洪俊,饶永彩.流式H L AGB27测定法在强直性脊柱炎诊断中的临床价值[J].职业与健康,2012,28(6):693G695.[5]卢峰,上官莉娟,陈涛,等.流式细胞仪检测H L AGB27在强直性脊柱炎筛查中的应用及分析[J].国际检验医学杂志,2017,38(13):1779G1783.[6]D U A N Q M,P U A P A I R O J C,R OM P H R U K A,e ta l.H L AGB∗27s u b t y p e si n N o r t h e r n a n d N o r t h e a s t e r nT h a i s,K a r e n s,a n dB a m a r sd e t e r m i n e db y ah i g hGr e s o l uGt i o nP C RGS S Pt e c h n i q u e[J].T i s s u e A n t i g e n s,2009,73(6):590G594.[7]闻海丰,冯忠军,韩文龙,等.实时荧光聚合酶链反应熔解曲线检测人类白细胞抗原B27方法建立及评价[J].临床荟萃,2015,30(6):674G676.[8]侯伟,许晓东.2种H L 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v,2014,13(6):615G620.(收稿日期:2017G11G21㊀修回日期:2018G02G22)2551 国际检验医学杂志2018年7月第39卷第13期㊀I n t J L a bM e d,J u l y2018,V o l.39,N o.13。
浙江地区强直性脊柱炎患者人白细胞抗原-B27基因亚型的分布状况及在临床诊断与个体化治疗中的应用一、立项背景和意义强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一种慢性、进行性的自身免疫性疾病,主要累及骶髋关节、脊柱及其四肢,多发生于青壮年,我国患病率达到0.3%,就此推算我国患病人数约为360万。
该病致残率高,严重影响人民健康和生活质量,目前临床常规治疗药物是非类固醇类抗炎药(NSAID)、柳氮磺嘧啶(SASP)及甲氨蝶呤(MTX)等,主要用于缓解症状,长期应用可引起诸多副作用。
目前多认为AS是在遗传性背景的基础上,免疫学、微生物学等多因素参与的结果,但具体发病机制仍不确切。
从1973年Brewerton和Schlosstein发现AS与人白细胞抗原-B27(HLA-B27)有强关联性以来,世界各地有大量的文献作了报道。
其一对HLA-B27的地域和民族分布状况做了较详细的研究,发现不同国家和地区的HLA-B27亚型与AS的关联程度不同,有的亚型甚至起到了保护作用。
有研究表明:不同种族和人群中,HLA-B27阳性比例不同,AS发病率不同;而且强直性脊柱炎特定的临床表现和病情严重性也与HLA-B27密切相关[1]。
其二对发病原因和机制提出了多种假说,如关节源性致病肽假说、重链表面异常折叠理论、蛋白质错误折叠理论、HLA-B27等位基因多态性等等。
但尚未阐明HLA-B27与疾病的真正原因。
而以上理论几乎都涉及到HLA-B27与AS发病的免疫机制有关。
已有确凿的证据表明,AS是与暴露在环境中的病原微生物有关,有非常明显的免疫交叉反应存在,其主要原因是错误的分子折叠导致原来提呈的抗原肽复合物与CD8+T细胞结合而变成了与CD4+T细胞的结合,产生一系列的细胞免疫反应。
大量的HLA-B27的错误折叠也导致了未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)加剧,使炎性反应更加强烈。
荧光定量PCR染料法在HLA-B27检测中的应用富显果;唐宝佳;杨菁;曹罗元;叶作东;黄宝英【摘要】目的探讨荧光定量PCR染料法检测HLA-B27基因对于诊断强直性脊柱炎的临床应用价值.方法应用流式细胞术和荧光定量PCR技术对强直性脊柱炎疑似患者170例进行HLA-B27基因及其亚型检测,对结果不一致样本,进一步应用PCR-直接测序法进行B27测序分析.结果两种方法检测符合率为92.9%,差异无统计学意义(P>0.05);5例结果不一致样本为流式细胞分析阳性,而荧光定量PCR法和PCR-直接测序分析为B* 40亚型或B*40与B*58的杂合型;在158例AS相关患者中,共检出3种HLA-B27等位基因:B*2704为主要亚型,占96.8%,其次为B*2705,占1.9%,另有2例为B*2706,占1.3%,结论荧光定量PCR染料法可有效提高HLA-B27检测的准确性,并能够实现HLA-B27亚型分析,可为深入探讨HLA-B27在AS中发病中的作用提供依据.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2018(022)006【总页数】4页(P939-942)【关键词】等位基因特异性PCR;荧光定量PCR;流式细胞术;强直性脊柱炎;HLA-B27【作者】富显果;唐宝佳;杨菁;曹罗元;叶作东;黄宝英【作者单位】福建医科大学附属宁德市医院中心实验室;福建医科大学附属宁德市医院检验科,福建宁德352100;福建医科大学附属宁德市医院血液风湿科;福建医科大学附属宁德市医院中心实验室;福建医科大学附属宁德市医院中心实验室;福建医科大学附属宁德市医院检验科,福建宁德352100;福建医科大学附属宁德市医院中心实验室【正文语种】中文【中图分类】R593.23人类白细胞抗原B27是6号染色体短臂上的主要组织相容性复合体基因B位点上的第27等位基因的表达产物。
既往研究表明 HLA-B27与强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)之间存在高度的相关性,AS患者中HLA-B27阳性率高达96%以上,而在健康人群中则少于10%[1,2]。
临床检验HLA-B27生化指标具体意义、强直性脊柱炎关联及阳性临床特征组织相容性复合物B27全称HLA-B27,是HLA家族成员。
HLA抗原是人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)表达产物,在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应,调节免疫应答的功能。
根据HLA抗原结构,功能与组织分布的不同,可分为三类:Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原,广泛分布于各组织有核细胞表面,包括血小板和网织红细胞,成熟红细胞不含HLA抗原;Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原,主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达,这两类抗原都与移植有关,其中Ⅱ类抗原更为重要;Ⅲ类分子为补体成分,HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因,基本上表达在机体中所有有核细胞上,淋巴细胞表面有丰富的含量。
与强直性脊柱炎相关性早在1973年就证实B27与强直性脊柱炎之间存在很强的关联性,27与强直性脊柱炎的联系是迄今已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型一种。
强直性脊柱炎患者B27阳性率高达90%以上,正常人群中仅仅为4-7%。
不同人群流行病学调查在不同种族、不同地区人群中,B27阳性的阳性率是不同的,因而强直性脊柱炎发病率也不同。
加拿大Haida族人阳性率最高,达到50%,4.3%人发生强直性脊柱炎;日本人B27阳性率很低,仅仅为0.5%,强直性脊柱炎发病率很罕见,仅仅为0.006%;而在印第安人群中,50%的人HLA—B27阳性,其中12%的人患强直性脊柱炎;欧美白种人中B27阳性率为4%~13%,而强直性脊柱炎的发病率为0.1-0.3%;而中国人群的B27阳性率为2%-8%,强直性脊柱炎发病率约为0.3%。
检查项目与指标诊断意义B27阳性并不一定是强直,B27阳性与强直性脊柱并没有绝对的相关性。
B27阳性并不是确诊强直性脊柱炎的唯一因素,诊断强直性脊柱炎需要结合临床症状包括腰背痛,骶髂关节X线,详细的体格检查等才能确诊。